獸藥人工抗原的合成方法.doc

獸藥人工抗原的合成方法1獸藥人工抗原的合成方法獸藥人工抗原合成的基本方法為獸藥半抗原與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。1.1半抗原的合成大多數(shù)的獸藥小分子不具有直接與載體蛋白質(zhì)交聯(lián)的功能團(tuán)（羧基和氨基），需要通過化學(xué)合成或衍生的方法首先制備出具有活性交聯(lián)功能團(tuán)的相應(yīng)半抗原。理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）應(yīng)具有待測物（待測的半抗原原型）的特征結(jié)構(gòu)，且與載體連接后應(yīng)保持該特征結(jié)構(gòu)能在最大程度為免疫細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合（能將該基團(tuán)暴露）。獸藥半抗原活性基團(tuán)種類主要有-NH2、-COOH、-OH、-SH，在與載體偶聯(lián)制備人工抗原時(shí)，有些活性基團(tuán)還需要先進(jìn)行選擇性保護(hù)和去保護(hù)，如阿維菌素半抗原的合成(李俊鎖等，1999)。不同的獸藥有不同的半抗原活化方法，目前獲得半抗原常用的方法有：對藥物分子進(jìn)行改造使之產(chǎn)生活性基團(tuán)；在藥物分子內(nèi)部引入活潑鹵元素，達(dá)到所需反應(yīng)的目的；利用原形藥物的代謝產(chǎn)物作為活潑半抗原；利用化學(xué)合成的方法合成有活性功能團(tuán)的半抗原；直接購買與半抗原結(jié)構(gòu)相似的有活性基團(tuán)的商品化學(xué)試劑。1.2獸藥人工抗原合成常用的載體常用于獸藥人工抗原合成的載體蛋白質(zhì)包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最為常用。因?yàn)锽SA理化穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)易得，分子內(nèi)自由氨基多，與半抗原偶聯(lián)率高，并且具有在不同pH值和離于強(qiáng)度下以及在含有某些有機(jī)溶劑狀態(tài)下都能保持較大的溶解度。近年來，國內(nèi)外都有文獻(xiàn)介紹以人工合成的多聚肽做載體(常用多聚L賴較氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于機(jī)體產(chǎn)生特異性更高的抗體，且具有比BSA更多的自由氨基(與BSA相當(dāng)分子量的多聚賴氨酸的自由氨基數(shù)約是BSA所含數(shù)目的10倍)，可以大大提高載體蛋白質(zhì)與半抗原的偶聯(lián)率。以多聚賴氨酸做載體來制備獸藥人工抗原尚未見報(bào)道，這應(yīng)該是一個(gè)值得探討的方向。1.3獸藥抗原的偶聯(lián)方法活化的半抗原與載體偶聯(lián)應(yīng)根據(jù)半抗原功能團(tuán)的不同，選用不同的偶聯(lián)劑和不同的偶聯(lián)方法。人工抗原合成的傳統(tǒng)方法有：混合酸酐法、活潑酯法及碳二亞胺法，用于羧基半抗原與載體的偶聯(lián)；戊二醛法或重氮化法用于氨基半抗原與載體的偶聯(lián)；氨基氧乙酸化用于酮基半抗原與載體的偶聯(lián)；丁二酸酐衍生化用于羥基半抗原與載體的偶聯(lián)。人工抗原合成的基因工程方法：利用基因工程技術(shù)表達(dá)特定抗原蛋白或通過核苷酸序列推導(dǎo)合成相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)抗原肽段，得到目的抗原。2影響獸藥人工抗原質(zhì)量的因素人工抗原的質(zhì)量好壞指其免疫原性的優(yōu)劣，受多種因素的影響。不同藥物的質(zhì)量影響因素也不盡相同，一方面取決于人工抗原本身的性質(zhì)，另一方面取決于接受該抗原刺激的機(jī)體的反應(yīng)性。概括起來主要有以下幾個(gè)方面。2.1抗原分子特性免疫學(xué)理論認(rèn)為抗原物質(zhì)除了要求具有一定的分子質(zhì)量(10ku)外，其表面還必須有一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)越復(fù)雜、支鏈越多，免疫原性越強(qiáng)，越易于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。對于具有多個(gè)載體偶聯(lián)位點(diǎn)的獸藥半抗原，以不同位點(diǎn)相偶聯(lián)制備的抗原，其相應(yīng)的特異性、親和性、效價(jià)也都不相同，即由于不同偶聯(lián)位點(diǎn)制備的抗原的空間結(jié)構(gòu)不同所致。所以，當(dāng)一個(gè)獸藥分子內(nèi)部有多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，要盡可能多合成不同的人工抗原，然后通過比較篩選出最好的抗原用于抗體制備。其次，半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比、間隔臂的長度、偶聯(lián)方法等也是影響人工抗原免疫原性的重要因素。過去人們認(rèn)為載體表面半抗原的密度越大，越有利于提高人工抗原的免疫原性，但相關(guān)的研究報(bào)道并非如此，這可能由于過多的半抗原影響了載體蛋白質(zhì)與淋巴細(xì)胞表面的接觸致使免疫反應(yīng)減弱所致。不同獸藥人工抗原具有不同的最佳偶聯(lián)比，一般來說當(dāng)偶聯(lián)比為3-451時(shí)免疫原性較強(qiáng)，也有研究者認(rèn)為最佳偶聯(lián)比為10-201。為了取得最佳免疫效果，不同的獸藥應(yīng)逐個(gè)確定與各種載體的最佳偶聯(lián)比?？乖肿拥奶厥饣瘜W(xué)基團(tuán)與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)受體接觸的難易程度影響著抗原的免疫原性的強(qiáng)弱。由于要求免疫系統(tǒng)對獸藥半抗原-載體結(jié)合物中載體遠(yuǎn)端的半抗原識(shí)別性強(qiáng)，故間隔臂應(yīng)選擇在遠(yuǎn)離待測物結(jié)構(gòu)的部分和官能團(tuán)，且應(yīng)具有一定的長度，以利于誘導(dǎo)高選擇性和高親和性的抗體。間隔臂的長度和結(jié)構(gòu)對抗體的特異性、效價(jià)可造成很大的干擾，太短，載體的空間位阻影響免疫系統(tǒng)的識(shí)別；過長，則可能由于間隔臂間的氫鍵或水交互作用而發(fā)生半抗原的“重疊”而影響免疫原性。再者，如果間隔臂的結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，制備的抗體則可能對間隔臂的親和力強(qiáng)而對待測物小分子的特異性弱?？梢圆扇煞N方法來減少間隔臂造成的不足，一是在半抗原的相同結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合載體蛋白，但免疫原和包被原應(yīng)使用不同的間隔臂；二是使用相同的間隔臂而選擇不同的結(jié)合位點(diǎn)。目前酶免疫分析中多支持間隔臂為36個(gè)碳原子直鏈結(jié)構(gòu)最有利于保護(hù)抗原決定簇、提高抗體特異性。2.2宿主生物系統(tǒng)不同種類或同種不同個(gè)體動(dòng)物對同一種免疫原的應(yīng)答有很大差別。這與受體動(dòng)物個(gè)體基因不同和動(dòng)物本身的發(fā)育和生理狀況不同有關(guān)。有些抗原對一種動(dòng)物有免疫原性而對另一種動(dòng)物卻無免疫原性，故選擇受體動(dòng)物時(shí)既要考慮適宜的品種，又要考慮所選動(dòng)物的健康狀況、生理狀態(tài)，一般選擇青壯年、雌性動(dòng)物，免疫應(yīng)答能力較強(qiáng)。2.3免疫方法的影響免疫原的劑量、接種途徑、次數(shù)及免疫佐劑的選擇，都明顯影響機(jī)體對抗原的應(yīng)答。免疫劑量過大會(huì)引起免疫耐受或動(dòng)物死亡；過少則不能引起免疫應(yīng)答。一般顆粒性抗原用量要少，可溶性蛋白和多糖抗原用量要適當(dāng)增大。免疫途徑以皮內(nèi)效果最好，次之為皮下，肌肉、腹腔、靜脈的效果稍差，口服易誘導(dǎo)免疫耐受。免疫佐劑選擇時(shí)要考慮到弗氏佐劑主要誘導(dǎo)IgG類抗體產(chǎn)生，明礬佐劑易誘導(dǎo)IgE類抗體產(chǎn)生。由于以上原因，免疫方案應(yīng)視不同動(dòng)物和免疫原的種類分別制定?？傊煌墨F藥人工抗原，其質(zhì)量影響因素不完全相同，常常需要在得到相應(yīng)的抗體后，根據(jù)抗體的特異性、親和性的優(yōu)劣，再對免疫復(fù)合物的具體合成方案進(jìn)行調(diào)整。3人工抗原的鑒定3.1紫外分光光度法此法為鑒定人工抗原最常用的方法。成功的人工抗原的紫外吸收圖譜應(yīng)與原載體蛋白質(zhì)的紫外圖譜有一定的差異，并且復(fù)合物與載體的差峰譜線應(yīng)與半抗原的譜線相同。根據(jù)蛋白質(zhì)的特定的吸收峰的光密度值和各自的原子摩爾消光系數(shù)計(jì)算出兩者的偶聯(lián)比。3.2標(biāo)記抗原示蹤法在進(jìn)行半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原時(shí)，使用一定量的標(biāo)記半抗原，反應(yīng)結(jié)束后測定透析前后的放射強(qiáng)度，從而可計(jì)算半抗原的偶聯(lián)比。也可以直接測定提取半抗原-蛋白質(zhì)結(jié)合物的放射性，計(jì)算偶聯(lián)比。3.3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳該方法根據(jù)人工抗原和原載體蛋白質(zhì)在條帶上的位置變化即可直接來判斷抗原合成的情況，并根據(jù)蛋白質(zhì)分子的相對遷移率計(jì)算偶聯(lián)比。3.4核磁共振通過測定純的半抗原和人工抗原中某些特征原子的核磁共振來直觀反映人工抗原合成是否成功，由所測定特征原子的濃度和蛋白質(zhì)的濃度來計(jì)算偶聯(lián)比。3.5其它方法也可以根據(jù)人工抗原和蛋白質(zhì)中氨基酸含量的變化來計(jì)算偶聯(lián)比。4展望近年來，因動(dòng)物性食品的獸