瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳檢測(cè)核酸實(shí)驗(yàn)-明德生物.docx

蘇州明德生物科技有限公司瓊脂糖（Agarose）凝膠電泳檢測(cè)核酸實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊牵ˋgarose）凝膠電泳是常用的檢測(cè)核酸的方法，學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識(shí)讀電泳圖譜的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖（Agarose）凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNAIDNAocDNA核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而pH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。在中性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致相同。影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：1、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度愈大，泳動(dòng)率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對(duì)泳動(dòng)率的影響不明顯。對(duì)線形分子來說，分子量的常用對(duì)數(shù)與泳動(dòng)率成反比，用此標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳并測(cè)定其泳動(dòng)率，然后進(jìn)行DNA分子長(zhǎng)度（bp）的負(fù)對(duì)數(shù)泳動(dòng)距離作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以用于測(cè)定未知分子的長(zhǎng)度大小。DNA分子的空間構(gòu)型對(duì)泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序?yàn)椋篶DNAIDNAocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化乙錠等的影響，會(huì)出現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈，并通過交聯(lián)劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由Acr與Bis的相對(duì)比例決定。瓊脂糖凝膠適合分離長(zhǎng)度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段（5bp-500bp）的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。3、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，不超過4V/cm。而對(duì)于大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進(jìn)行高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。4、緩沖液離子強(qiáng)度核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制DNase，保護(hù)DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide GELRED）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。254nm的紫外線照射時(shí)，靈敏度最高，但對(duì)DNA損傷嚴(yán)重；360nm紫外線照射時(shí)，雖然靈敏度較低，但對(duì)DNA損傷小，所以適合對(duì)DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對(duì)DNA損傷不是很大，所以也比較適用。使用溴化乙錠對(duì)DNA 樣品進(jìn)行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5g/ml的GELRED。GELRED摻入DNA分子中，可以在電泳過程中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，但是如果要測(cè)定核酸分子大小時(shí)，不宜使用以上方法，而是應(yīng)該在電泳結(jié)束后，把凝膠浸泡在含0.5g/mlGELRED的溶液中1030min進(jìn)行染色。BE見光分解，應(yīng)在避光條件下4保存。三、材料、試劑及器具1、材料DNA/Hind Marker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）；質(zhì)粒提取物；酶切產(chǎn)物；連接產(chǎn)物。2、試劑加樣緩沖液（6x）：0.25% 溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖（Agarose）； GelRed熒光核酸凝膠染色試劑；酶液（10mg/ml）。3、器具（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。（2）紫外透射儀。四、操作步驟1、按所分離的DNA分子的大小范圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60左右，在膠液內(nèi)加入適量的GelRed至濃度為0.5g/ml。2、取有機(jī)玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴(yán)，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。5、在槽內(nèi)加入0.5TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面6、把待檢測(cè)的樣品，按以下量在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。1l加樣緩沖液（6）+5l待測(cè)DNA樣品+0.5l GelRed液（0.5mg/ml）（注：若膠內(nèi)未加GelRed，可選用此法）。7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。8、觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。當(dāng)其移動(dòng)至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。9、染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上，放進(jìn)GelRed溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約30min。10、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈（360nm或254nm），通過觀察孔進(jìn)行觀察。五、注意事項(xiàng)1、電泳中使用的化學(xué)試劑，務(wù)必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時(shí)更換。2、預(yù)先加入GelRed時(shí)可能使 DNA的泳動(dòng)速度下降15%左右，而且對(duì)不同構(gòu)型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用0.5g/ml的GelRed溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加GelRed，染色步驟可省略；若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加GelRed，也建議增加此步。3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除，否則，需重新制膠。4、以0.5TBE作為電泳緩沖液時(shí)，溴酚蘭在0.5%1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大約相當(dāng)于300bp的線性DNA的泳動(dòng)速度，而二甲苯青FF的泳動(dòng)速度相當(dāng)于4Kb的雙鏈線形DNA的泳動(dòng)速度。 蘇州明德生物科技有限公司是一家創(chuàng)辦于2012年的創(chuàng)新型高科技企業(yè)，自公司成立以來一直以“客戶第一”為公司核心價(jià)值觀，專注于為生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。主要經(jīng)營(yíng)生物試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材、儀器設(shè)備本公司代理、經(jīng)銷試劑品牌Acros、Merck、Sigma、TCI、Amresco等，生物試劑品牌invitrogen，Abcam、 ABGENE、ABI、ABR、BD pharmingen、CST、ELISA試劑盒、GE、Hyclone、Millipore、Pierce