蛋白質(zhì)生物合成1.ppt

第十三章蛋白質(zhì)的生物合成BiosynthesisofProtein 教學(xué)目的與要求 1 掌握遺傳密碼的原理和特點(diǎn) tRNA運(yùn)載氨基酸的機(jī)理 蛋白質(zhì)生物合成過程 2 熟悉原核細(xì)胞與真核細(xì)胞在蛋白質(zhì)合成上的區(qū)別 蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾 3 了解細(xì)胞中蛋白質(zhì)的穿膜 真核生物蛋白質(zhì)的分泌 教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn) 蛋白質(zhì)合成的過程教學(xué)安排 6課時 DNA DNA RNA 蛋白質(zhì) 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 逆轉(zhuǎn)錄 基因遺傳 基因表達(dá) 生物中心法則 忠實(shí)復(fù)制 忠實(shí)轉(zhuǎn)錄 忠實(shí)翻譯 一 遺傳密碼 遺傳密碼 geneticcode 指mRNA中的核苷酸序列與多肽中氨基酸序列之間的對應(yīng)關(guān)系 通常是指核苷酸三聯(lián)體決定氨基酸的對應(yīng)關(guān)系 故也稱三聯(lián)體密碼或密碼子 1 三聯(lián)體密碼的破譯 1954年物理學(xué)家GamovG首先對遺傳密碼進(jìn)行探討 41 4 42 16 43 64 足以編碼20種氨基酸 密碼子 codon 應(yīng)是三聯(lián)體 triplet Gamov確認(rèn)核酸分子中三個堿基決定一個氨基酸 1961年Crick等用遺傳學(xué)方法也證實(shí)三聯(lián)體密碼子學(xué)說是正確的 Nirenberg以均聚物共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成 尋找到了破譯遺傳密碼的途徑 Khorana以共聚物指導(dǎo)多肽的合成 加快了破譯遺傳密碼的步伐 核糖體結(jié)合技術(shù)完全破譯了遺傳密碼 密碼子或稱三聯(lián)體密碼 即mRNA上決定一個特定氨基酸的三個核苷酸 用各種人工合成模板在體外翻譯蛋白質(zhì)的方法確定用核糖體結(jié)合技術(shù)測定密碼子中的核苷酸排列順序1961 1965年4年時間 完全確定了編碼20種天然氨基酸的密碼子 編出了遺傳密碼字典 2 密碼子的確定 1961年 Nirenberg建立體外無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系 證明了mRNA的模板作用 細(xì)菌 礬土顆粒 輕輕研磨 細(xì)菌液 離心 去除細(xì)胞壁和膜 提取液 DNA mRNA tRNA 核糖體 酶 離子 DNA水解酶 20種氨基酸等 蛋白質(zhì) 3 遺傳密碼的破譯 poly U UUU 多聚苯丙氨酸 UUU是Phe的密碼子 poly C CCC 多聚脯氨酸 CCC是Pro的密碼子 poly A AAA 多聚賴氨酸 AAA是Lys的密碼子 保溫 蛋白質(zhì)合成停止 polyU ATP GTP 氨基酸 多聚苯丙氨酸 提取液 DNA mRNA tRNA 核糖體 酶 離子 在外無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中 以兩種核苷酸或三種核苷酸的共聚物作模板 重復(fù)試驗(yàn) 1 以多聚二核苷酸作模板可合成由2個氨基酸組成的多肽 如以Poly UG n為模板 合成產(chǎn)物為PolyLys Val 以特定的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成 2 以多聚三核苷酸作為模板 可得3種氨基酸組成的多肽 如以Poly UUC n為模板 合成產(chǎn)物為PolyPhe PolySer PolyLeu UUCUUCUUCUUCUUCUUC UUC UUC UUC UUC UUC UUC PolyPheU UCU UCU UCU UCU UCU UC PolySerUU CUU CUU CUU CUU CUU C PolyLeu 遺傳密碼字典 U A C G UCAG U C A G 第二位 第一位 5 第三位 3 UCAG UCAG UCAG 核糖體結(jié)合技術(shù) 技術(shù)要點(diǎn) 保溫 硝酸纖維濾膜過濾 分析留在濾膜上的核糖體 AAtRNA 確定與核糖體結(jié)合的AA 以人工合成的三核苷酸為模板 核糖體 AA tRNA 二 遺傳密碼的基本特征 1 遺傳密碼的連續(xù)性 commaless 密碼子之間沒有任何起 標(biāo)點(diǎn) 作用的空格 閱讀mRNA時是連續(xù)的 一次閱讀3個核苷酸 堿基 在絕大多數(shù)生物中 閱讀mRNA時是以密碼子為單位 不重疊地閱讀 少數(shù)大腸桿菌噬菌體的RNA基因組中部分基因的遺傳密碼是重疊的 2 遺傳密碼的不重疊性 nonoverlapping 1 除Met AUG 和Trp UGG 外 每個氨基酸都有兩個或更多的密碼子 這種現(xiàn)象稱為密碼子的簡并性 degenecy 2 同義密碼 同一個氨基酸的不同密碼子稱同義密碼子 synonyms 3 簡并性的生物學(xué)意義 減少有害突變 對生物物種的穩(wěn)定有一定意義 4 密碼的簡并性往往表現(xiàn)在密碼子的第三位堿基上 3 遺傳密碼具有簡并性 degeneracy tRNA上的反密碼子與mRNA上的密碼子配對時 密碼子的第一位 第二位堿基配對是嚴(yán)格的 第三位堿基可以有一定變動 Crick稱這種現(xiàn)象為密碼的擺動性或變偶性 wobble 在密碼子3 端的堿基和反密碼子5 端的互補(bǔ)堿基之間形成的相對松散的堿基配對 搖擺現(xiàn)象 顯然 密碼子的專一性基本取決于前兩位堿基 第三位堿基起的作用有限 有較大靈活性 所以幾乎所有氨基酸的密碼子都可以用XYA G 和XYU C 來表示 4 密碼的變偶性 擺動性 wobble 切記 在書寫或閱讀密碼子 反密碼子的堿基順序時 一定都按5 3 方向閱讀 tRNA反密碼子中除A U G C四種堿基外 還經(jīng)常在第一位出現(xiàn)次黃嘌呤 I I可以與A U C三者之間形成堿基對 使帶有次黃嘌呤的反密碼子可以識別更多的簡并密碼子 由于變偶性的存在 細(xì)胞內(nèi)只需要32種tRNA 就能識別61個編碼氨基酸的密碼子 原核和真核細(xì)胞都只合成約30種帶有反密碼子的tRNA 5 遺傳密碼的通用性和變異性 1 通用性 指各種低等和高等生物 包括病毒 細(xì)菌及真核生物 基本上共用一套遺傳密碼 2 密碼的變異性 目前已知線粒體DNA mtDNA 的編碼方式與通用遺傳密碼子有所不同 6 密碼子有起始密碼子和終止密碼子 1 起始密碼子 AUG Met 多數(shù)原核 真核生物GUG少數(shù)情況 2 終止密碼子 UAA UAG UGA不編碼任何氨基酸 又稱為無義密碼子 nonsensecodons 或終止密碼子 chain terminatingcodons 它們單個或串聯(lián)在一起用于多肽鏈翻譯的結(jié)束 沒有相應(yīng)的tRNA存在 許多原核生物在mRNA的起始密碼子上游約10個核苷酸處 10區(qū) 通常有一段富含嘌呤核苷酸的序列 與16SrRNA的3 端部分互補(bǔ) 有助于mRNA與核糖體小亞基的結(jié)合 該序列最初是由Shine Dalgarno發(fā)現(xiàn)的 故稱之為SD序列 Shine Dalgarnosequence 關(guān)于SD序列 二 核糖體 一 核糖體是蛋白質(zhì)合成的工廠用放射性同位素標(biāo)記氨基酸 注射到小鼠體內(nèi) 經(jīng)短時間后取出肝臟 制成勻漿 離心 分離各細(xì)胞器 發(fā)現(xiàn)核糖體放射性最強(qiáng) 說明核糖體是蛋白質(zhì)合成部位 二 核糖體的結(jié)構(gòu) 原核生物 真核生物 三 核糖體的活性位點(diǎn) 四 核糖體的功能 參與多肽鏈的啟動 延長 終止 并 移動 含有遺傳信息的模板mRNA Up to dateViewpoint 核糖體是1種核酶 它催化肽鍵的形成 將蛋白質(zhì)生物合成牢牢地控制在RNA的手中 三 轉(zhuǎn)移RNA的功能 在蛋白質(zhì)合成中 tRNA起著運(yùn)載氨基酸的作用 按照mRNA鏈上的密碼子所決定的氨基酸順序?qū)被徂D(zhuǎn)運(yùn)到核糖體的特定部位 tRNA有兩個關(guān)鍵部位 3 端CCA 接受氨基酸 形成氨酰 tRNA 需ATP提供活化氨基酸所需的能量 與mRNA結(jié)合部位 反密碼子部位 tRNA的接頭作用 此外 tRNA上尚有 3 識別氨酰tRNA合成酶的位點(diǎn) 4 核糖體識別位點(diǎn) 3 5 I CCA OH 5 3 CCA OH GGC CCG 密碼子與反密碼子的閱讀方向均為5 3 兩者反向平行配對 四 蛋白質(zhì)生物合成的分子機(jī)制 一 肽鏈延伸合成的方向和速度1 方向N端 C端2 速度肽鏈延伸的速度極快 一個核糖體合成一條完整的血紅蛋白 鏈 146個AA 需3分鐘 平均0 8AA 秒 大腸桿菌20個AA 秒 二 mRNA上翻譯的方向 1 用人工合成的多核苷酸作模板證明 5 pAAA AAA n AAC OH3 H2N 賴氨酸 賴氨酸 n 天冬酰胺 COOH2 翻譯方向 5 3 三 原核生物蛋白質(zhì)生物合成的分子機(jī)制 蛋白質(zhì)生物合成過程可人為劃分為五個階段 氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延長肽鏈合成的終止和釋放肽鏈合成后的折疊和加工處理 核糖體多肽的合成 1 氨基酸的激活 氨基酸在消耗能量 ATP 的情況下被共價結(jié)合于tRNA3 端的過程 反應(yīng)是由依賴于Mg2 的氨酰 tRNA合成酶催化的 1 部位 細(xì)胞質(zhì) 2 酶 氨酰 tRNA合成酶 3 能量 消耗2ATP 4 產(chǎn)物 氨酰 tRNA甲酰化產(chǎn)物fMet tRNA 原核生物起始AA 5 激活過程 AA ATP EAA AMP E PPi Mg2 Mn2 AA AMP E tRNA 氨酰 tRNA AMP E 氨基酸激活的總反應(yīng)式是 氨酰 tRNA合成酶 氨基酸 ATP tRNA H2O 氨酰 tRNA AMP PPi 20種氨基酸中 每一種氨基酸都有各自特異的氨酰 tRNA合成酶 第一步反應(yīng) 氨基酸 ATP E 氨?；?AMP E PPi 氨?；?AMP 氨?；?AMP E tRNA氨?；?tRNA AMP E 氨?；?tRNA AA tRNA 氨酰基 tRNA合成酶 氨?；?AMP 第二步反應(yīng) 氨酰 tRNA合成酶特點(diǎn) 氨酰 tRNA合成酶具有高度的專一性 它既能識別相應(yīng)的氨基酸 L 構(gòu)型 又能識別與此氨基酸相對應(yīng)的一個或多個tRNA分子 氨酰 tRNA合成酶具有校對功能 即使AA識別出現(xiàn)錯誤 此酶具有水解功能 可以水解非正確組合的氨基酸和tRNA之間形成的共價聯(lián)系 這種高度專一性和校對作用 保證了氨基酸與特定的tRNA準(zhǔn)確匹配 從而使蛋白質(zhì)的合成具有一定的保真性 翻譯過程的錯誤頻率 10 4 氨基酸激活的總反應(yīng)式是 氨酰 tRNA合成酶 氨基酸 ATP tRNA H2O氨酰 tRNA AMP PPi 1 起始氨基酸及起始tRNAi 起始氨基酸 原核 甲酰甲硫氨酸fMet 真核 甲硫氨酸Met 起始氨酰 tRNAi 甲硫氨酰 tRNAi甲?；?甲?；蟛拍芘cIF2結(jié)合生成30S復(fù)合物 甲?；乐蛊鹗及被徇M(jìn)入延伸中的肽鏈 使fMet tRNAi結(jié)合在核糖體P部位 延長因子EF Tu識別未甲?；腗et tRNA 2 肽鏈合成的起始 核糖體的激活 大小亞基分離 mRNA與小亞基結(jié)合 起始氨?；?tRNA與小亞基結(jié)合 核糖體大亞基結(jié)合 p 30S A IF1 IF 3 IF1 30S亞基結(jié)合IF3 IF3的結(jié)合阻止了30S與50S亞基的過早結(jié)合 有利于30S與mRNA結(jié)合 mRNA的起始信號引導(dǎo)30S亞基準(zhǔn)確結(jié)合到AUG位置 IF3 mRNA與小亞基結(jié)合 起始氨?；?tRNA與小亞基結(jié)合 5 AUUCCU GACAUG GGCAGCAAC 3 SD序列 Shine Dalgaro序列 翻譯起始序列 在mRNA起始密碼子AUG的上游約10個核苷酸處有一段富含4 9個嘌呤的序列 稱為SD 序列 該序列能與30S亞基的16SrRNA富嘧啶的序列互補(bǔ) 實(shí)現(xiàn)mRNA rRNA相互識別作用 使mRNA的AUG能正確地定位于翻譯起始位點(diǎn) 50S亞基 p 50S A 70S起始復(fù)合物 核糖體大亞基結(jié)合 2 70S起始復(fù)合物的形成 分三步 核糖體30S小亞基與起始因子IF3結(jié)合 再與mRNA結(jié)合 形成30S mRNA IF3復(fù)合物 在IF1參與下 30S mRNA IF3進(jìn)一步與fMet tRNAf IF2 GTP結(jié)合 并釋放IF3 形成30S mRNA fMet tRNA復(fù)合物 50S核糖體大亞基與該復(fù)合物結(jié)合形成70S起始復(fù)合物 并釋放IF1 IF2 GDP Pi 3 肽鏈的延長 肽鏈的延長分為4個步驟 進(jìn)位轉(zhuǎn)肽脫落移位 核糖體循環(huán) 1 進(jìn)位 1 一個新的氨酰 tRNA進(jìn)入A位2 延長因子參加3 消耗1個GTP 原核生物蛋白質(zhì)合成的延伸因子 2 轉(zhuǎn)肽 1 肽酰基從P位轉(zhuǎn)到A位 肽鍵的形成 2 負(fù)責(zé)肽鍵合成的酶稱為肽酰轉(zhuǎn)移酶 peptityltransferase 簡稱轉(zhuǎn)肽酶 3 肽的轉(zhuǎn)移是核糖體大亞基 50S或60S 的功能 4 抗菌素嘌呤霉素抑制蛋白質(zhì)合成 使新生的肽鏈在合成未完成之前就釋放出來 3 脫落 轉(zhuǎn)肽后 P部位上空載的tRNA經(jīng)出口位點(diǎn) E 脫落 4 移位 1 核糖體向mRNA3 端移動一個密碼子 移位導(dǎo)致肽酰 tRNA從A位點(diǎn)移出 進(jìn)入P位點(diǎn) 空著的A位點(diǎn)為下一個密碼子對應(yīng)的氨酰 tRNA的進(jìn)入作好準(zhǔn)備 2 需要1個GTP 3 三位點(diǎn)模型 1989年德國的Nierhaus等提出模型認(rèn)為 細(xì)菌tRNA及mRNA相對于核糖體發(fā)生移位后 空載tRNA并未立即從核糖體上解離下來 而是移到了E位點(diǎn) 出口位點(diǎn) 當(dāng)新的氨酰 tRNA結(jié)合到A位點(diǎn)時 E位點(diǎn)的空載tRNA才解離下來 此過程涉及到核糖體構(gòu)象的變化 該變化有利于核糖體對正確氨酰 tRNA的識別作用 從而提供了蛋白質(zhì)合成的精確性 4 肽鏈合成的終止與釋放 1 終止信號1 終止密碼子 UAA UGA UAG正常細(xì)胞不含能和終止密碼子互補(bǔ)的反密碼子的tRNA 這些終止密碼子能被終止因子所識別 2 釋放因子 releasefactor RFs RF1 識別UAA UAGRF2 識別UAA UGARF3 不識別終止密碼子 但刺激另外兩個因子的活性 協(xié)助肽鏈釋放 2 終止機(jī)制 1 釋放因子與終止密碼子結(jié)合使轉(zhuǎn)肽酶活性變成水解酶活性 水解了P位點(diǎn)上多肽與tRNA之間的鍵 釋放出多肽和tRNA 2 在基因中 終止密碼子總是緊接在編碼最后一個氨基酸的密碼子后面 任何一個三聯(lián)密碼發(fā)生無義突變時都足以終止其基因的蛋白質(zhì)合成 3 在原核生物的基因中 UAA是最常見的終止密碼 其它依次為UGA和UAG 但閱讀UGA存在更多的錯誤 錯誤閱讀終止密碼就是一個氨酰 tRNA對它產(chǎn)生錯誤反應(yīng) 使蛋白質(zhì)合成繼續(xù)進(jìn)行 直到另一個終止密碼出現(xiàn) 多核糖體 是一個mRNA分子與一定數(shù)目的單個核糖體結(jié)合而成的 形成念珠狀 每個核糖體可以獨(dú)立完成一條肽鏈的合成 提高了翻譯的效率 原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián) 5 肽鏈的折疊和加工處理 前體蛋白是沒有活性的 常常要進(jìn)行一系列翻譯后加工 才能成為有功能的成熟蛋白 蛋白質(zhì)合成后的加工主要有以下幾種方式 1 氨基端和羧基端的修飾 在原核生物中幾乎所有蛋白質(zhì)都是從N 甲酰蛋氨酸開始 真核生物從蛋氨酸開始 甲?；?jīng)酶水解而除去 蛋氨酸或者氨基端的一些氨基酸殘基常由氨肽酶催化而水解除去 因此 成熟的蛋白質(zhì)分子的N 端沒有甲?；?或沒有蛋氨酸 同時 某些蛋白質(zhì)分子氨基端要進(jìn)行乙?；?在羧基端也要進(jìn)行修飾 2 除去信號肽 某些蛋白質(zhì)氨基端有一段15 30個氨基酸殘基的順序 這段順序稱作信號肽 與蛋白質(zhì)傳送到特定的細(xì)胞器 膜 或分泌出細(xì)胞外有關(guān) 信號肽在運(yùn)送過程中通常由專一的酶催化而水解除去 3 羥基氨基酸的磷酸化 某些蛋白質(zhì)分子中的絲氨酸 蘇氨酸 酪氨酸殘基的羥基 在酶催化下被ATP磷酸化 磷酸化在酶的活性調(diào)節(jié)中有重要意義 4 羧化反應(yīng) 某些蛋白質(zhì) 如凝血酶等凝血因子 含有多個 羧基Glu 這一羧基是在需VitK的酶催化下進(jìn)行的 5 羥基化反應(yīng) 膠原蛋白中的脯氨酸與賴氨酸的羥基化 由相應(yīng)的羥基化酶催化完成 6 甲基化反應(yīng) 某些蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基需要甲基化 某些谷氨酸殘基的羧基也要甲基化 以除去負(fù)電荷 7 加糖鏈 糖蛋白的糖鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)合成之后 在通過高爾基體時 經(jīng)過糖化而形成的 糖鏈或加在天冬氨酸殘基上 或加在絲氨酸 蘇氨酸殘基上 8 加輔基 蛋白質(zhì)與輔基的結(jié)合也是在翻譯之后進(jìn)行的 如乙酰CoA羧化酶的輔基 生物素和細(xì)胞色素C的血紅素 9 二硫鍵的形成 真核細(xì)胞合成的某些蛋白質(zhì) 往往能自發(fā)地折疊形成其天然構(gòu)像 分子內(nèi)的半胱氨酸的巰基之間形成共價鍵 二硫鍵 二硫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)型中起著重要作用 例如胰島素分子的成熟是借核糖體上釋放的前胰島素原經(jīng)自發(fā)折疊 形成二硫鍵 然后再切除C肽而形成的 10 蛋白質(zhì)前體的裂解 一種蛋白質(zhì)前體能產(chǎn)生多種多肽激素 如垂體產(chǎn)生的幾種小肽激素是來源于同一個大的蛋白質(zhì)前體 11 新生肽鏈折疊成有活性的構(gòu)象 需要分子伴侶 molecularchaperones 輔助 12 蛋白質(zhì)自我剪接 1990年 Hirata等首次報道一種新的蛋白質(zhì)加工方式 蛋白質(zhì)自我剪接 他們發(fā)現(xiàn) 釀酒酵母細(xì)胞基因TFP1表達(dá)生成兩種蛋白 較大的 69 103 是液泡H ATPase的催化亞基 它來自TFP1基因5 編碼區(qū)和3 編碼區(qū) 較小的 50 103 是由該基因中央?yún)^(qū)編碼的 他們證明 這兩種蛋白是同一條多 肽鏈經(jīng)過自我剪接產(chǎn)生的 較小的蛋白是被切割下來的部分 較大的蛋白在切除較小蛋白后再連接而成 蛋白質(zhì)自我剪接在原核生物和單細(xì)胞真核生物中均已發(fā)現(xiàn) 迄今已在20多種生物的近30種蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)蛋白內(nèi)含肽 這些蛋白質(zhì)大約一半?yún)⑴c核酸代謝 蛋白內(nèi)含肽常具有一定的生物活性 如核酸內(nèi)切酶的活性 此外 許多蛋白內(nèi)含肽插入至蛋白質(zhì)高度保守區(qū) 如活性中心附近 這一方面迫使蛋白質(zhì)前體必須經(jīng)過剪接才能成熟 另一方面也有利于蛋白內(nèi)含肽自我保護(hù) 切除 連接 蛋白質(zhì)的自我剪接 四 蛋白質(zhì)合成所需的