凱氏法蛋白質(zhì)測定.ppt

第十一講食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定 1 蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物 分子量很大 主要由C H O N S五種元素組成 某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P Cu Fe I等 在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì) 可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物 如核酸 含氮碳水化合物 生物堿等 含氮類脂 卟啉和含氮的色素 第一節(jié)概述 食品中蛋白質(zhì)的含量 第一節(jié)概述 測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量 再由總氮量計算出樣品中的蛋白質(zhì)含量 食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定 主要 也是最常用的 用凱氏定氮法測定總氮量和杜馬法 這里也包括非蛋白的氮 所以只能稱為粗蛋白的含量 但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測 第一節(jié)概述 一些蛋白質(zhì)的含氮量 第一節(jié)概述 一些蛋白質(zhì)的含氮量一般為15 17 6 有的上下浮動可以測出總氮N N 6 25 蛋白質(zhì)含量 第一節(jié)概述 2 蛋白質(zhì)定量法 利用蛋白質(zhì)共性的方法 定氮法雙縮脲法物理法 利用特定氨基酸殘基法 染料結(jié)合法福林 酚試劑法 凱氏定氮法 最常用的 國內(nèi)外應(yīng)用普遍 第一節(jié)概述 一 凱氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出 現(xiàn)發(fā)展為常量 微量 自動定氮儀法 半微量法及改良凱氏法 書中只介紹前三種 1 原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化 digest 使蛋白質(zhì)分解 其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出 而樣品中的有機(jī)氮 organicnitrogen 轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨 然后加堿蒸餾 使氨蒸出 用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 整個過程分三步 消化 蒸餾 吸收與滴定 1 消化總反應(yīng)式 加硫酸鉀作為增溫劑 提高溶液沸點 純硫酸沸點340 加入硫酸鉀之后可以提高至400 以上 也可加入硫酸鈉 氯化鉀等提高沸點 但效果不如硫酸鉀 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 加硫酸銅作為催化劑 還可以作消化終點指示劑 做蒸餾時堿性指示劑 還可以加氧化汞 汞 均有毒 價格貴 硒粉 二氧化鈦 加氧化劑如雙氧水 次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 消化裝置 自動回流消化儀 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 2 蒸餾消化完全的樣品溶液 濃氫氧化鈉使呈堿性 加熱蒸餾 即可釋放出氨氣 NH4 2SO4 2NaOH NH3 Na2SO4 2H2O 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 3 吸收與滴定 titration 吸收 加熱蒸餾所放出的氨 硼酸溶液滴定 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 硼酸呈微弱酸性 Ka1 5 8 10 10 用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng) 它有吸收氨的作用也可采用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收 然后再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定吸收液中過剩的硫酸或鹽酸 從而計算總氮量 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 2 適用范圍 application 此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定 3 試劑濃硫酸 脫水 氧化硫酸銅 催化劑及消化指示劑硫酸鉀 提高溶液的沸點氫氧化鈉混合指示劑硼酸鹽酸 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 4 操作方法 1 消化 固體樣品0 2 2g 半固體樣品2 5g 液體樣品10 20ml 加入催化劑及濃硫酸進(jìn)行消化至溶液綠色透明 同時做空白實驗 2 蒸餾 按裝置進(jìn)行連接 奈氏試劑檢查 無紅棕色物質(zhì)生成 檢查氨是否全部蒸完 蒸餾過程中用硼酸吸收 3 滴定用0 1000mol L鹽酸滴定至由蘭色變?yōu)槲⒓t色 甲基紅為指示劑 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 5 蛋白質(zhì)計算 V1 V0 C 0 014 F 100蛋白質(zhì) m nV1 V0 滴定時所耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù) C 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的當(dāng)量濃度 0 14 1毫升當(dāng)量氮的克數(shù) F 氮的蛋白質(zhì)換算系數(shù) m 樣品克數(shù) n 稀釋倍數(shù) 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 6 注意事項當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時 可將凱氏燒瓶冷卻 加入30 過氧化氫2 3m1后再繼續(xù)加熱消化 消化時不要用強(qiáng)火 應(yīng)保持和緩沸騰 以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失 樣品含脂肪或糖較多時 消化時間要長些 同時注意消化過程中產(chǎn)生泡沫溢出瓶外 在蒸餾過程中注意接頭處有無松漏現(xiàn)象 蒸餾完畢后 應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口 再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源 否則可能造成吸收液倒吸 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 二 微量凱氏定氮法 1 原理及適用范圍同前2 與常量法不同點 加入硼酸量有50ml10ml 滴定用鹽酸濃度由0 1mol L0 01mol L 可用微量滴定管 3 蒸餾裝置 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 三 自動凱氏定氮法 1 原理及適用范圍同前2 特點 1 消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶 紅外線加熱的消化爐 2 快速 一次可同時消化8個樣品 30分鐘可消化完畢 3 自動 自動加堿蒸餾 自動吸收和滴定 自動數(shù)字顯示裝置 可計算總氮百分含量并記錄 12分鐘完成1個樣 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 四 雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣 靈敏度高 準(zhǔn)確 不要大儀器 但費時間 有環(huán)境污染 新開發(fā)的 雙縮脲法 紫外分光光度法 染料結(jié)合法 水楊酸比色法等 都是快速測定蛋白質(zhì)的方法 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 1 原理當(dāng)脲 尿素NH2 CO NH2 加熱至150 160 時 可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲 也叫雙縮脲 反應(yīng)式如下 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物 此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng) 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 蛋白質(zhì)分子含有肽鍵 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似 故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比 據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量 該配合物的最大吸收波長為560nm 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 2 方法特點及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低 但操作簡單快速 故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法 本法亦適用于豆類 油料 米谷等作物種子及肉類等樣品測定3 主要儀器 分光光度計 離心機(jī) 4000r min 4 試劑 1 堿性硫酸銅溶液 2 四氯化碳 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 5 操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線 顯色 加入試劑靜置1小時 比色 取上清離心 樣品的測定顯色比色查標(biāo)準(zhǔn)曲線 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 6 結(jié)果計算蛋白質(zhì) mg 100g 式中 c 由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù) m 樣品質(zhì)量 g 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 7 說明及注意事項 蛋白質(zhì)的種類不同 對發(fā)色程度的影響不大 有大量脂肪存在時 會出現(xiàn)混濁可以先脫脂 標(biāo)準(zhǔn)曲線作完整后 無需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品含有脯氨酸且有大量糖類存在時 顯色不好還會出現(xiàn)結(jié)果偏低 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 五 紫外吸收法 1 原理 利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán) 對紫外光有吸收作用在280nm下 吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系 求含量 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 2 適用范圍 常用于生物化學(xué)工作 因為干擾因素多 故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛 3 主要儀器 紫外分光光度計 離心機(jī) 3000 5000r min 4 操作 用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線 第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定 第三節(jié)揮發(fā)性鹽基氮的測定 揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶和細(xì)菌的作用 在腐敗過程中 使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì) 此類物質(zhì)具有揮發(fā)性 在堿性溶液中蒸出后 用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定計算含量 1 原理揮發(fā)性鹽基氮遇到弱堿氧化鎂游離蒸餾出來 蒸餾出來的氨 被硼酸吸收后生成硼酸銨 使吸收液變?yōu)閴A性 混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色 再由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定至紫色 2 試劑2 1氧化鎂混懸液 10g L 稱取1 0g氧化鎂 加100mL水 振搖成混懸液 2 2硼酸吸收液 20g L 2 3鹽酸 c HCL 0 01mol L 或硫酸 c 1 2H2SO4 0 01mol L 的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液 2 4甲基紅乙醇指示劑 2g L 2 5次甲基藍(lán)指示劑 1g L 3 分析步驟樣品處理 精確取10g試樣 粉碎好的樣品 于200mL磨口三角瓶中 加100 0mL V總 蒸餾水于振蕩器上振蕩30分鐘 4000轉(zhuǎn)離心 蒸餾滴定 將盛有20 0mL吸收液及5 6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端 并使其下端插入吸收液的液面下 準(zhǔn)確吸取10 0mL V分取 上述樣品上清液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi) 加10mL氧化鎂混懸液 10g L 迅速蓋塞 并加水以防漏氣 通入蒸汽 進(jìn)行蒸餾 蒸餾5min即停止 吸收滴定 吸收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液0 01mol L 或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定 終點至藍(lán)紫色 同時做試劑空白試驗 4 計算式及結(jié)果表述 V1 V0 c 14X 100m 5 100 第四節(jié)氨基酸定量測定 一 甲醛滴定法1 原理氨基酸具有酸性的 COOH基和堿性的 NH2基 它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽 當(dāng)加入甲醛溶液時 NH2基與甲醛結(jié)合 從而使其堿性消失 這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定 COOH基 并用間接的方法測定氨基酸總量 2 方法特點及應(yīng)用此法簡單易行 快速方便 在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化 以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況 并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一 3 試劑 40 中性甲醛溶液 以百里酚酞作指示劑 用氫氧化鈉將40 甲醛中和至淡藍(lán)色 0 1 百里酚酞乙醇溶液0 1mol L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 4 操作方法樣品溶液 氨基酸約20 30mg 50ml蒸餾水加入3滴百里酚酞指示劑 中性甲醛20ml 搖勻 靜置1分鐘 0 1mol L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 淡蘭色 終點 記錄所消耗的堿液ml數(shù) 5 結(jié)果計算X V2 VI C 0 014 100 V式中 X為樣品中氨基氮含量 g 100g V2 百里酚酞作指示劑時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積 ml V1 空白液消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積 ml C 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度 mol L V 為樣品液取用量 ml 0 014 為氮的毫摩爾質(zhì)量 g mmol 6 說明及注意事項此法適用于測定食品中的游離氨基酸 固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎 準(zhǔn)確稱樣后用水萃取 然后測定萃取液 液體試樣如醬油 飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定 萃取可在500C水浴中進(jìn)行0 5小時即可 若樣品顏色較深 可加適量活性炭脫色后再測定 或用電位滴定法進(jìn)行測定 與本法類似的還有單指示劑 百里酚酞 甲醛滴定法 此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和 COOH基時的pH為8 5 9 5 但分析結(jié)果稍偏低 雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確 誤差脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物 使結(jié)果偏低 酪氨酸含有酚羧基 滴定時也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高 溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng) 往往使結(jié)果偏高 二 電位滴定法 1 原理根據(jù)氨基酸的兩性作用 加入甲醛以固定氨基的堿性 使羧基顯示出酸性 將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池 用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點 2 儀器酸度計 磁力攪拌器 微量滴定管3 試劑20 中性甲醛溶液 參考甲醛滴定法試劑0 05mol L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液4 操作方法pH8 2 計算總酸含量 pH9 2 試劑空白試驗 5 結(jié)果計算X V1 V2 C 0 014 100 V式中 X為樣品中氨基酸的含量 g l00ml V1 測定用樣品加人甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積 ml V2 試劑空白試驗加人甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 ml V 樣品稀釋液取用量 ml C 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度 mol L 0 014 氮的毫摩爾質(zhì)量 g mmol 6 說明本法準(zhǔn)確快速 可用于各類樣品游離氨基酸含量測定對于渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定 三 其他方法 1 茚三酮比色法 ninhydrinmethod 原理氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用 生成藍(lán)紫色 Ruhemannpurplecolor 化合物 除脯氨酸外均有此反應(yīng) 該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比 其最大吸收波長為570nm 故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量 2