白細胞的檢測方法.doc

第四章 白細胞檢驗的基本方法第一節(jié) 白細胞功能的檢驗一、墨汁吞噬試驗 【目的】 掌握墨汁吞噬試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?墨汁吞噬試驗（ink phagocytosis test）是依據(jù)血液中的中性粒細胞及單核細胞對細菌、異物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，經(jīng)37溫育4h，涂片染色后，在顯微鏡下觀察吞噬細胞對墨汁的吞噬情況，并計算吞噬率及吞噬指數(shù)，從而協(xié)助急性白血病的診斷與鑒別。 【材料】1器材 試管、移液管、微量移液器、載玻片、37水浴箱、顯微鏡等。2試劑 （1）肝素：配成6U/ml水溶液。 （2）制備墨汁：于普通硯臺上加生理鹽水5ml，以優(yōu)質(zhì)中國塊墨或印度墨，以100r/min研磨3min。所得墨汁經(jīng)普通濾紙過濾3次備用。 （3）瑞氏染液等。 【方法步驟】 1取小試管1支，加肝素20l，加外周血100l，混勻。 2加入過濾墨汁10l，混勻，加塞。 3置37溫育4h。4取溫育后樣本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。 5油鏡下觀察計數(shù)幼稚細胞或中性成熟粒細胞100個；計數(shù)單核細胞20個。 6判斷結(jié)果 根據(jù)細胞吞噬墨粒多少及大小，可定為下列程度： 陰性：細胞內(nèi)未見吞噬墨粒。 陽性：(+) 細胞內(nèi)吞噬有小墨粒15個。 (+) 細胞內(nèi)吞噬有大小不等墨粒10個左右。 (+) 細胞內(nèi)吞噬有大墨粒10個左右，小墨粒較多。 (+) 細胞內(nèi)吞噬有多數(shù)大顆墨粒，并有塊狀、球狀，小墨粒很多，但細胞核清楚。 7計算吞噬率及吞噬指數(shù) 吞噬率（%）= 100%吞噬指數(shù)= 【注意事項】 肝素劑量對白細胞的吞噬功能有影響，肝素用量過大，細胞形態(tài)異常，吞噬率和吞噬指數(shù)降低；肝素用量過小，影響抗凝。以每100l血用0.3U肝素為最適宜?！緟⒖挤秶?成熟中性粒細胞吞噬率5989%，吞噬指數(shù)66186；成熟單核細胞吞噬率90100%，吞噬指數(shù)227399。 【臨床意義】 臨床上可利用該試驗了解吞噬細胞的吞噬功能，對白血病的診斷和分型有一定參考價值。粒細胞僅成熟階段才具有吞噬功能，單核細胞幼稚階段和成熟階段均具有吞噬能力。AML-M5a為弱陽性，M5b吞噬指數(shù)明顯增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬試驗均為陰性，AML-M4呈陽性反應(yīng)。CML的成熟粒細胞吞噬能力明顯降低。二、白細胞吞噬功能試驗 【目的】 掌握白細胞吞噬功能試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?白細胞吞噬功能試驗（leukophagocytic function test），是將待測的白細胞與葡萄球菌混合，37溫育一定時間后，細菌可被中性粒細胞吞噬，涂片染色后，在顯微鏡下觀察中性粒細胞吞噬細菌的情況，計數(shù)吞噬細菌的白細胞數(shù)以及被吞噬的細菌總數(shù)，計算吞噬率和吞噬指數(shù)，據(jù)此反映中性粒細胞的吞噬功能?！静牧稀?器材 接種環(huán)、小試管、微量細胞培養(yǎng)板、水浴箱、載玻片、顯微鏡等。2試劑（1）制備菌液：取在瓊脂斜面上或平板上培養(yǎng)24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L pH6.4）洗2次，沸水浴1520min滅菌。將滅活菌液混懸于20% FCS-RPMI1640培養(yǎng)液中，用比濁法調(diào)整細胞濃度至51010/L，置4備用。（2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆薩染液等。 【方法步驟】 1于微量細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)（或小試管內(nèi)）加100U/ml肝素1滴，無菌采集末梢血3滴，與孔內(nèi)抗凝劑立即混勻。 2向孔內(nèi)（或小試管內(nèi)）加白色葡萄球菌懸液3滴，混勻。 3置有蓋濕盒內(nèi)，37溫育30min，每10min輕搖一次。 4用滴管取1滴培養(yǎng)液，推成薄片，甲醇固定，吉姆薩染色、干燥。 5鏡檢計數(shù) 油鏡下觀察計數(shù)200個中性粒細胞，記錄吞噬細菌的細胞數(shù)，以及各個細胞吞噬的細菌總數(shù)，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）= 100%吞噬指數(shù)= 【注意事項】1 所用器材要清潔。2 抗凝劑用量應(yīng)適當(dāng)，過高會抑制吞噬功能，過低則易出現(xiàn)血液凝固。3 要嚴(yán)格掌握吞噬的時間和條件。細菌與細胞比例以1110為宜。4 涂片要薄，以便盡量減少因細菌重疊在細胞上而誤以為吞噬的錯誤。 5計數(shù)時應(yīng)取載玻片前、中、后三段計數(shù)，以提高準(zhǔn)確性。6本試驗采用光學(xué)顯微鏡檢查，分辨率不夠高，有時難以準(zhǔn)確計數(shù)吞入的細菌顆粒，應(yīng)認(rèn)真識別。7應(yīng)根據(jù)各室的具體方法建立本室參考范圍，以便客觀地判定被測標(biāo)本中性粒細胞的吞噬能力?！緟⒖挤秶?吞噬率：健康人為61.464.2%。吞噬指數(shù)：健康人為1.011.11?！九R床意義】 白細胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本試驗可作為判斷機體白細胞功能狀態(tài)，診斷白細胞本身所致疾病的參考。1吞噬率和吞噬指數(shù)增高，反映中性粒細胞吞噬異物功能的增強，常見于細菌性感染。2吞噬率和吞噬指數(shù)降低，見于機體免疫功能低下；營養(yǎng)、代謝、腫瘤等因素致白細胞分化不良或不成熟，如粒細胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤等；機體存在明顯抑制白細胞的因素，如免疫抑制劑、抗白細胞抗體等。三、血清溶菌酶活性試驗【目的】 掌握血清溶菌酶活性試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?血清溶菌酶活性試驗（serum lysozyme activity test），是利用溶菌酶能水解革蘭氏陽性球菌細胞壁的乙酰氨基多糖成分，使細胞壁裂解，用對溶菌酶較敏感的微球菌懸液為作用底物，根據(jù)微球菌的溶解程度來檢測血清或尿中溶菌酶的活性。（一）平板打孔法【材料】1器材 接種環(huán)、毛細滴管、無菌打孔器（孔徑5mm左右）、水浴箱、測量尺等。2試劑（1）等滲緩沖液(pH 6.4)：A液：磷酸二氫鉀9.07g，氯化鈉5.0g，溶于1 000ml蒸餾水中。B液：磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)23.87g，氯化鈉5.0g，蒸餾水加至1000ml。A液、B液以103比例混合，調(diào)至pH6.4。（2）制備溶壁微球菌： 制備營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基：取瓊脂4.3g，加牛肉浸膏1.0g，蒸餾水100ml，浸10min后煮沸，使其完全溶解，倒入若干大試管，加塞，高壓消毒15min，取傾向位室溫冷卻，置4冰箱保存，備用； 接種：溶壁微球菌在使用前于瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代一次，試驗前按常規(guī)接種微球菌于斜面，置37培養(yǎng)2448h，即可長出黃色菌落； 制備細菌懸液：用無菌蒸餾水洗下菌苔，2000r/min離心30min，棄上清。再加蒸餾水輕輕混勻，2000r/min離心30min，棄上清，稱沉淀物濕重，用無菌蒸餾水配成100g/L的濃菌液（菌液應(yīng)在臨用前配制，不宜存放過久），7080加熱滅菌，備用。（3）1%瓊脂：稱瓊脂粉1g，加入1/15mol/L pH 6.4 PBS 100ml。（4）溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液：取溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，用1/15mol/L pH 6.4 PBS制成5、25、100mg/L稀釋液。（5）被檢血清?！痉椒ú襟E】1制備溶壁微球菌瓊脂平板 取已配制好的菌液1ml，加到5060已溶化的1%瓊脂中，搖勻，傾注平板（直徑79cm平板加1%瓊脂15ml），待冷凝。2打孔 用打孔器在溶壁微球菌瓊脂平板上打孔，孔間距1820mm，用牙簽挑去孔內(nèi)瓊脂。3加樣 用毛細滴管吸取血清，加入瓊脂孔內(nèi)。同時在另一孔內(nèi)加滿溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液作為陽性對照。4溫育 置2530溫育1824h，觀察結(jié)果。5制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 在每批測定同時，將各種濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液加入小孔中，同上法測定溶菌環(huán)的直徑。在半對數(shù)紙上，以溶菌酶濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），溶菌環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從曲線上查出每毫升待檢品所含溶菌酶的微克數(shù)。6判斷結(jié)果 加血清孔和溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液孔周圍的溶壁微球菌被溶解，可見圓形透亮區(qū)，即溶菌環(huán)。溶菌環(huán)的直徑大小與溶菌酶的含量成正比?！咀⒁馐马棥繙y量標(biāo)準(zhǔn)品與待檢樣品溶菌現(xiàn)象的間隔時間應(yīng)盡量縮短，最好能在同一塊板上備有標(biāo)準(zhǔn)品的對照，以便比較。（二）比濁法【材料】1器材 接種環(huán)、試管、721型分光光度計、水浴箱、微量移液器等。 2試劑 （1）等滲緩沖液(pH 6.4)：同平板打孔法 （2）制備溶壁微球菌：同平板打孔法。將制備的菌液過濾，取上清液于分光光度計600nm波長處，以緩沖液調(diào)零，調(diào)節(jié)菌液濃度使其光密度為0.4，冰箱保存。 （3）制備溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液：稱取干燥溶菌酶2mg，用pH6.4的等滲緩沖液溶解，其酶濃度為lmg/ml(1000g/ml)，儲存液置冰箱保存，備用。溶菌酶應(yīng)用液則取0.1ml溶菌酶儲存液加4.9ml緩沖液，稀釋50倍，其酶含量為20g/ml。 【方法步驟】 1將菌液置37水浴中預(yù)溫2min。 2抽取患者血液，分離血清，按表4-1進行操作。表4-1 溶菌酶測定步驟 加入物 標(biāo) 準(zhǔn) 管 菌液對照管 測定管 1 2 3 4 5 6微球菌液(m1) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 緩沖液（1） 20 40 60 80 100 一溶菌酶應(yīng)用液(1) 80 60 40 20 一 一(每隔1min加入)血清(1) 100 混勻，每管于37水浴中準(zhǔn)確溫育10min，取出即加反應(yīng)終止液5mol/L NaOH(ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 3以緩沖液調(diào)零，600nm波長處比濁，檢測各管的光密度。4計算 -5制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 以測得各標(biāo)準(zhǔn)管的光密度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)管所含標(biāo)準(zhǔn)酶濃度為橫坐標(biāo)（第1管含酶16g/ml，依次為12g/ml，8g/ml，4g/ml），菌液對照管的光密度為零點，在坐標(biāo)紙上畫一曲線。6根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出被測血清樣品所含溶菌酶的量。 【注意事項】 1菌液4保存比較穩(wěn)定。溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液以高濃度4保存為佳。 2每批溶菌酶樣品的測定須同時作標(biāo)準(zhǔn)管與菌液對照管的測定。 3血清標(biāo)本4保存10d，酶活性基本不變。4該法可同時用于測定尿中的溶菌酶活性，但要收集24h尿量，并加防腐劑，所得結(jié)果乘以尿量。5該法只適用于測定較窄濃度范圍的溶菌酶，因此，測定前應(yīng)先將待檢樣品的濃度作適當(dāng)調(diào)整，使之適用于限定的測定范圍。 6細胞溶菌酶測定 血和離心后的菌液各1滴，混合后制成涂片，置含濕紗布玻皿內(nèi)，于37溫育30min，干燥后瑞氏染色、鏡檢。細胞周圍菌少，變細、變淡，并可見透明環(huán)為陽性。 【參考范圍】 血清515mg/L；尿02mg/L?！九R床意義】 人體血清中的溶菌酶，主要來自血中的單核細胞和粒細胞，其中以單核細胞含量最多。在中性粒細胞中，從中幼粒到成熟粒細胞，其溶菌酶的含量可隨細胞的成熟程度而增高。在嗜酸性粒細胞，除中幼階段外，其余均無此酶。淋巴細胞中含量極低。血清和血漿中的溶菌酶大部分是由破碎的白細胞所釋放。白血病患者血清溶菌酶含量的變化很大，與其細胞類型有密切關(guān)系。 1增高 主要見于急性髓細胞白血?。篈ML-M5其血清溶菌酶含量明顯增高，因外周血中成熟單核細胞增多導(dǎo)致溶菌酶釋放增多所致，且增高程度與成熟單核細胞多少有關(guān)。尿溶菌酶含量也增高，故尿溶菌酶陰性可排除AML-M5的診斷。AML-M4其血清溶菌酶含量也明顯增高，其增高程度與白細胞總數(shù)有關(guān)。在治療前其含量明顯高，表示細胞分化程度較好，預(yù)后亦較好。急性粒細胞白血病，其血清溶菌酶的含量可正?；蛟龈?，臨床意義與急性粒-單細胞白血病相似。急粒和急單在治療緩解，白細胞減少時，其含量也同時下降，但在復(fù)發(fā)時上升。2減低或正常 ALL其血清溶菌酶含量多數(shù)減低，少數(shù)正常；CML其血清溶菌酶含量正常，但急變時下降。 四、硝基四氮唑藍還原試驗 【目的】 掌握硝基四氮唑藍還原試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?硝基四氮唑藍還原試驗(nitroblue tetrazolium reduction test)，是觀察中性粒細胞對硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)還原作用的試驗。NBT是一種染料，其水溶液呈淡黃色。當(dāng)被吞入或滲入中性粒細胞后，有產(chǎn)生過氧化物酶的作用，并可接受己糖旁路代謝途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作用產(chǎn)生的NADPH氧化脫下的氫，而被還原成非水溶性的藍黑色甲月替（formazan）顆粒，并呈點狀或斑塊狀顆粒沉淀于胞質(zhì)內(nèi)有酶活性的部位，可在顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞百分比，借此反映中性粒細胞的殺菌功能。【材料】1器材 小試管、滴管、載玻片、水浴箱、顯微鏡等。2試劑 （1）0.15mol/L pH7.2磷酸緩沖葡萄糖生理鹽水(PBGS)：取0.15mol/L Na2HPO4溶液7.6ml，0.15mol/L KH2PO4溶液2.4ml及0.15mol/L NaCl 10ml，混勻，加20mg葡萄糖，溶后過濾分裝，8磅高壓蒸汽滅菌20min，4保存。 （2）NBT試劑：取NBT l0mg，加入生理鹽水5ml。室溫振搖1h溶解(NBT難溶，亦可置80水浴中搖動或攪拌助溶)，濾去少數(shù)不溶性顆粒后，小量分裝，此即貯存液，4可保存36個月。用時取需要量與等量PBGS混勻即為NBT試劑。 （3）肝素溶液：無防腐劑肝素注射液，用生理鹽水稀釋成1.25105U/L。 （4）10g/L沙黃(safranin)水溶液：取沙黃1g，先加l2ml 95%乙醇助溶，然后邊振蕩邊加蒸餾水使之溶解成l00ml。濾紙過濾后，室溫避光保存。 （5）甲醇等。 【方法步驟】 1取一小試管，加肝素溶液0.05ml，再加受檢者外周靜脈血0.5ml，混勻。2取抗凝血0.1ml與等量NBT試劑在小試管內(nèi)混勻，蓋住管口。置37溫育25min，中間振搖1次，再置室溫15min。 3輕輕搖勻細胞，用滴管吸出1滴于載玻片上，推成涂片，立即吹干。甲醇固定23min，吹干。10g/L沙黃水溶液染色5min，水沖洗，待干。 4鏡檢計數(shù) 油鏡下觀察，凡中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)含有點狀或斑塊狀深藍色甲月替顆粒沉著者(只見一個典型顆粒也算)，即為NBT陽性細胞。計數(shù)100200個中性粒細胞，算出NBT還原陽性細胞百分率。 【注意事項】 1所用器材要清潔，避免玻璃表面因素增加NBT還原作用。2NBT試劑需用超細玻璃器過濾，不要殘留顆粒；注意保存，不要被細菌污染。 3孵育方式不同，會影響檢出結(jié)果，在水浴內(nèi)孵育的NBT還原陽性率會比在普通溫箱中孵育者高。 4涂片要推出頭、體、尾，并厚薄適宜。太厚影響觀察；太薄則細胞難找，計數(shù)費時。5單核細胞也可能還原NBT，應(yīng)注意。聚集的或己破損的中性粒細胞，不可計數(shù)在內(nèi)。 6常有血小板粘附在中性粒細胞上，易與甲月替顆?；煜?，應(yīng)仔細區(qū)別。 7如無沙黃，也可用50g/L甲基綠染色15min代替；也可用瑞-吉染色，但切忌染液干涸在載玻片上?！緟⒖挤秶?正常成人的NBT陽性細胞數(shù)在10%以下。若有10%以上中性粒細胞能還原NBT，即為NBT還原試驗陽性；低于10%則為陰性。 【臨床意義】 一般認(rèn)為中性粒細胞在吞噬殺菌過程中，能量消耗驟增，己糖磷酸旁路代謝活性增強，還原NBT形成甲月替的能力也隨之增強。故此試驗可用于定性檢測中性粒細胞產(chǎn)生O2的能力，以間接判斷中性粒細胞的殺菌能力。1用于中性粒細胞吞噬殺菌功能異常的篩選和輔助診斷 NBT還原試驗陰性見于兒童慢性肉芽腫(CGD)、G-6-PD缺乏癥、家族性X染色體連鎖致死性肉芽腫（FFG）、髓過氧化物酶缺乏癥和Job氏綜合征（高IgE、IgA）時。如在涂片中能查出幾個出現(xiàn)甲月替沉淀的中性粒細胞即可排除CGD。如在涂片中未查出有甲沉月替淀的中性粒細胞，即為可疑CGD時，可作細菌內(nèi)毒素激發(fā)試驗確診之。方法如下：將1g大腸桿菌內(nèi)毒素溶于5ml生理鹽水，取0.05ml與0.5ml肝素抗凝血(12.5U肝素/m1血)在試管內(nèi)混勻，蓋住管口置室溫15min后，按前述方法進行NBT還原試驗若NBT還原陽性細胞超過29%，即可否定CGD；若仍在l0%以下，即可診斷為中性粒細胞吞噬殺菌功能異常。 2鑒別細菌感染和病毒感染 細菌感染時，中性粒細胞數(shù)量增多，粒細胞糖分解代謝活性增強，因此，全身性細菌感染時，患者的NBT還原陽性細胞通常在10%以上，而病毒感染或其他原因發(fā)熱的患者則在10%以下。但若細菌感染而無內(nèi)毒素等激發(fā)白細胞還原NBT的物質(zhì)入血時，也可在10%以下。而病毒感染時常不增加或相對降低。 3器官移植后發(fā)熱的鑒別 器官移植后發(fā)熱，若非細菌感染所致，其NBT還原試驗陰性；若該試驗陽性，則提示可能有細菌感染。 4無丙種球蛋白血癥、鐮狀細胞病、惡性營養(yǎng)不良、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等，以及應(yīng)用激素、細胞毒藥物、保泰松等治療時，NBT還原陽性細胞比例可降低。5新生兒、小兒成骨不全癥、心肌梗死急性期，淋巴肉瘤，變應(yīng)性血管炎、膿瘡性銀屑病、皮肌炎、某些寄生蟲感染(如瘧疾)、全身性真菌感染(如白色念珠菌性敗血癥)、注射傷寒菌苗后、口服避孕藥或孕酮后，NBT還原陽性細胞比例可增高。 五、白細胞趨化試驗 【目的】 掌握白細胞趨化試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?白細胞趨化試驗（white blood cell chemotaxis test），是在趨化室微孔濾膜的一側(cè)放入粒細胞，另一側(cè)放入趨化因子（細菌毒素、補體C3a、小淋巴因子等），檢測離體粒細胞潛過濾膜到達趨化因子這一側(cè)定向移動的能力。 【材料】1器材（1）趨化室：用有機玻璃自制，分上、下兩室，上室直徑5.5mm，下室直徑5.5mm，深8mm的圓形孔室，有兩條直徑4.5mm的孔道與外界相通。趨化室上室用于放置白細胞懸液，下室置趨化因子，中間隔以合適的濾膜。 （2）濾膜：直徑13mm，孔徑3m、5m、8m，厚150m，混合纖維素酯濾膜。 （3）離心管、滴管、載玻片、顯微鏡等。 2試劑（1）趨化因子：健康人(或豚鼠)新鮮血清34份混合，分裝后-20-40凍存24h(可用大腸桿菌培養(yǎng)液、酵母多糖活化血清、淋巴細胞衍生趨化因子等)。 （2）白細胞懸液：在10ml離心管中依次加入下述A、B、C、D四種濃度梯度液各2ml： A液：90.0g/L Ficoll 15.0ml加500.0g/L Hypague 10ml，相對密度1.14； B液：90.0g/L Ficoll 17.5ml加500.0g/L Hypague 10ml，相對密度1.13； C液: 90.0g/L Ficoll 20.0ml加500.0g/L Hypague 10ml, 相對密度1.12； D液：90.g/L Ficoll 24.0ml加339.0g/L Hypague 10ml，相對密度1.08。在D液上層加入用生理鹽水12稀釋的受檢者肝素抗凝血(10U/ml)2ml，1000r/min離心40min，在血漿與D液界面為單個核細胞，C、B界面為中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，B、A界面為嗜酸性粒細胞。 （3）甲醇、蘇木素染液、乙醇等。 【方法步驟】（膜濾法）1將趨化因子0.5m1(用培養(yǎng)基作陰性對照)自外側(cè)孔注入趨化室下室，封閉孔道，上室加入白細胞懸液0.3ml，37培養(yǎng)2h。2取出濾膜，甲醇固定后，在蘇木素染液中染色15min，用蒸餾水沖洗。乙醇脫色。3再依次在70%、90%、100%的乙醇(或異丙醇)中脫水，每種濃度中各脫水35min。4將濾膜貼于載玻片上，封片。5鏡檢計數(shù) 油鏡下觀察濾膜。原來向上的一面為淋巴細胞與單核細胞，原來向下的一面只含移動過來的中性粒細胞(用孔徑3m的濾膜)，觀察時應(yīng)調(diào)節(jié)鏡頭焦距，計算5個高倍視野中中性粒細胞數(shù)(約250個)。陰性對照觀察2030個視野。通常以雙份濾膜內(nèi)移動細胞的平均數(shù)為趨化單位。 【注意事項】 1測定白細胞趨化功能時，應(yīng)作預(yù)實驗以選擇最適白細胞濃度、最適趨化因子濃度。2注意固定采用一種計數(shù)方法，即濾膜下表面計數(shù)法或濾膜內(nèi)計數(shù)法。3濾膜的質(zhì)量、厚度、孔的大小都能對趨化功能產(chǎn)生較大的影響，因此應(yīng)使用統(tǒng)一濾膜。 4各實驗室應(yīng)建立自己方法的參考范圍。 【參考范圍】 趨化指數(shù)3.03.5。 【臨床意義】 趨化性是粒細胞在趨化因子的作用下到達炎癥局部所必需的功能。趨化因子的量增多，細胞趨化移動加快。1趨化指數(shù)增高 主要見于細菌感染，其趨化指數(shù)常迅速增高。病毒感染，尤其是感染的早期，趨化指數(shù)常在正常范圍內(nèi)，故該試驗在鑒別不明原因的感染中有參考價值。2趨化功能減低 主要見于：遲鈍白細胞綜合征（lazy-leukocyte syndrome）、Wiskot-Aldrich綜合征、幼年型牙周炎、糖尿病、尿毒癥、燒傷、新生兒、慢性皮膚粘膜白色念珠菌病、高IgE綜合征、先天性魚鱗病、膜糖蛋白(相對分子量ll kDa)缺陷癥、肌動蛋白功能不全癥、Chediak-Higashi綜合征。當(dāng)趨化因子生成不足或其抑制因子過多時也可出現(xiàn)趨化功能異常。 六、吞噬細胞吞噬功能試驗 【目的】 掌握吞噬細胞吞噬功能試驗的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?吞噬細胞吞噬功能試驗（phagocyte phagocytic function test ），是檢測吞噬細胞吞噬功能的方法之一。活體巨噬細胞、單核細胞在體內(nèi)外均有很強的吞噬細菌、異物的功能。在體外將吞噬細胞與異體細胞或細菌混合孵育后，染色觀測其吞噬異體細胞或細菌的數(shù)量，可了解其吞噬功能。利用中藥斑蝥在人的前臂皮膚上發(fā)皰，造成非感染性炎癥，誘使單核細胞游出血管大量聚集于皰液內(nèi)，抽取皰液即為天然提純的吞噬細胞懸液。以雞紅細胞（CRBC）為靶細胞，經(jīng)體外37溫育后，涂片染色，顯微鏡下觀察吞噬細胞對雞紅細胞的吞噬消化活性，并計算吞噬率和吞噬指數(shù)，以判斷吞噬細胞的吞噬功能。 【材料】1器材 眼科鑷子、長鑷子、濾紙、蓋玻片、37水浴箱、離心機、載玻片、顯微鏡等。 2試劑 （1）10%的斑蝥酊劑：斑蝥10g，95%乙醇90ml，浸泡2周以上。 （2）5%雞紅細胞懸液。 （3）Aisever保存液：取葡萄糖2g、枸櫞酸鈉0.8 g、枸櫞酸0.055g、氯化鈉0.42g，加入蒸餾水100ml。配成后68.95kPa，10min消毒。 （4）生理鹽水。 （5）吉姆薩染液。 （6）甲醇等。 【方法步驟】 1制備皮皰液 （1）先用眼科鑷子取lcm2大小的濾紙2張，蘸上10%斑蝥乙醇浸出液，貼敷在前臂屈側(cè)皮膚上，在濾紙下壓一塊血細胞計數(shù)板蓋玻片，上面再敷以消毒紗布，用橡皮膏固定之。 （2）45h后，將濾紙、蓋玻片和紗布一并取下?lián)Q上一個拱形塑料蓋，以防止開始形成的水皰破裂。 （3）48h后，在前臂皮膚上可形成一個同蓋玻片一樣大小的水皰，用無菌注射器或三棱針小心將皮皰液全部擠出。最后，局部涂以消炎藥膏，以無菌紗布敷蓋。 2制備5%雞紅細胞（CRBC）懸液 （1）自雞的一側(cè)翅翼下靜脈取血，將雞血加到置有Alsever液的消毒青霉素瓶中，充分混勻。血與Alsever液的比例為15。放4冰箱可保存半個月。 （2）臨用前用生理鹽水洗滌雞紅細胞3次，頭2次離心為1500r/min離心3min，第3次2000r/min離心5min，按紅細胞壓積用生理鹽水配成5%的雞紅細胞懸液。 3吞噬細胞吞噬功能檢測 （1）斑蝥刺激皮皰液lml，加5%的雞紅細胞懸液0.04ml，置硅化離心管中混勻，置37溫育30min，每10min輕輕搖動一次。 （2）1000r/min離心l0min，棄上清。 （3）取沉淀細胞涂片，干后用甲醇固定，吉姆薩染色(吉姆薩染液用緩沖液作14稀釋)。 （4）鏡檢計數(shù)：油鏡下觀察吞噬細胞吞噬消化雞紅細胞的情況，并至少計數(shù)200個吞噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）= 100%吞噬指數(shù)= 【注意事項】1斑蝥浸液對皮膚有刺激作用，其用量應(yīng)適當(dāng)、恒定。用量過多，反應(yīng)過強，48h后皮皰液內(nèi)中性粒細胞較多，使用適當(dāng)，才可獲大量的巨噬細胞。2取皮皰液時，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，并盡可能吸凈皮皰液，如不易抽出，可從不同角度抽吸，因殘留的皮皰液易導(dǎo)致繼發(fā)感染。3若皮皰液中蛋白過高，易凝固，可在試管內(nèi)加入適量抗凝劑。4皮皰液不能立即檢查時，可置4冰箱放置24h，對巨噬細胞形態(tài)和功能無影響。5最好設(shè)正常對照，便于判斷結(jié)果的可靠性。6必須掌握好吞噬作用時間，時間過長被吞噬的雞紅細胞可被消化，時間過短則未被吞噬。7涂片的厚薄應(yīng)適宜，太厚影響觀察；太薄則細胞難找，計數(shù)費時。8通常應(yīng)計數(shù)200500個細胞。計數(shù)少，影響結(jié)果的可靠性?！緟⒖挤秶?吞噬率： 61.3964.15%；吞噬指數(shù)：1.0091.107?！九R床意義】 吞噬細胞是機體單核吞噬系統(tǒng)的重要組成部分，其在組織中含量多，分布廣，移動力強且能識別腫瘤細胞，在機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用。本試驗可測定吞噬細胞的非特異性吞噬功能，在吞噬細胞功能檢測的基礎(chǔ)理論研究和臨床治療方面都有重要意義。1巨噬細胞吞噬功能低下，主要見于各種惡性腫瘤，如食道癌、胃癌、腸癌、宮頸癌等，其吞噬率常低于45%，腫瘤消除后可以上升，故可作為腫瘤病人手術(shù)、化療、放療及免疫治療療效觀察的參考指標(biāo)。2一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作為預(yù)測感染發(fā)生的概率、觀察療效及判斷預(yù)后的指標(biāo)。 第二節(jié) 白細胞代謝及其產(chǎn)物檢驗一、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶檢測【目的】 掌握末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶檢測的原理、方法、注意事項和臨床意義。（一）酶免疫組織化學(xué)檢測【實驗原理】 酶免疫組織化學(xué)檢測（enzyme immunohistochemistry assay）是利用一種DNA聚合酶，即末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)，直接催化細胞的脫氧核苷酸，使其轉(zhuǎn)移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3-OH端，合成單鏈DNA。兔抗牛TdT抗體能和人細胞的TdT產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可采用免疫熒光技術(shù)或酶標(biāo)免疫細胞化學(xué)技術(shù)，用辣根過氧化物酶-抗酶復(fù)合物在細胞涂片上定位，顯示細胞內(nèi)的TdT。【材料】1器材 離心管、載玻片、微量移液器、滴管、37水浴箱、離心機、顯微鏡等。2試劑（1）淋巴細胞分離液（相對比密為1.077）。（2）過氧化氫-甲醇固定液：甲醇液中含H2O2濃度為0.03%(V/V)，4冰箱保存。（3）0.1mol/L磷酸鹽緩沖掖(pH7.2)。（4）正常兔血清lgG。（5）兔抗牛TdT抗體（作1:8稀釋）。（6）羊抗兔IgG（作1:10稀釋）。（7）PAP免疫復(fù)合物（作1:20稀釋）。（8）二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)溶液：0.05mol/L Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)l00ml，含過氧化氫(V/V)0.03%，4冰箱保存，用前加入30mg DAB，溶解后過濾，立即避光使用?！痉椒ú襟E】1用淋巴細胞分離液分離新鮮抗凝血，取淋巴細胞層細胞離心涂片或直接涂片、待干。2將涂片用過氧化氫-甲醇液于4固定2030min。3將涂片置0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡15min。4滴加兔抗牛TdT抗體，置37濕盒內(nèi)溫育30min。用0.1mol/L PBS沖洗2次。5滴加羊抗兔lgG抗體，置37濕盒內(nèi)溫育30min。用0.1mol/L PBS沖洗2次。6滴加PAP免疫復(fù)合物，置37濕盒內(nèi)溫育30min。用0.lmol/L PBS沖洗2次。7加入DAB溶液顯色，室溫避光作用510min。水洗5min，干后鏡檢。也可用哈氏蘇木素液復(fù)染胞核10min后再行鏡檢?！咀⒁馐马棥?標(biāo)本必須新鮮，以保證待測抗原活性。2抗體、PAP復(fù)合物和封閉血液不可反復(fù)凍融，應(yīng)放4保存。3一抗、二抗和PAP復(fù)合物的溫育必須在濕盒內(nèi)進行。加抗體和PAP復(fù)合物加樣量應(yīng)以足以蓋過血膜為宜。在溫育過程中切忌液體干涸和分布不均勻。4去除內(nèi)源性過氧化物酶所用的H2O2濃度宜為3%4%，濃度過高會影響細胞抗原和細胞形態(tài)的完整性。5若用幾種抗體同時檢測不同的抗原，在第一抗體溫育和漂洗過程中，要避免交叉污染。6雙PAP法的重復(fù)標(biāo)記可提高對微弱抗原的檢出率，但以重復(fù)2次為宜，否則會增加非特異性著色和背景污染?！九袛嘟Y(jié)果】 陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，定位在細胞核上。TdT為早期T淋巴細胞的標(biāo)志，在正常情況下不成熟的胸腺淋巴細胞出現(xiàn)陽性反應(yīng)?！九R床意義】 95%以上ALL和大約30%慢粒急淋變患者外周血細胞呈陽性反應(yīng)，病情緩解后陽性率逐漸減弱。在ALL中，由于細胞表面標(biāo)志不同，TdT活性也有變化，T-ALL，non-T-ALL，non-B-ALL細胞的陽性率很高。B-ALL細胞陰性。當(dāng)外周血中此酶活性升高，預(yù)示血細胞的惡性變。因此TdT的測定對急性白血病的鑒別和治療監(jiān)測有一定意義。 （二）放射性同位素檢測【實驗原理】 以3H或14C標(biāo)記的脫氧腺苷三磷酸等的dXTP為基質(zhì)，用低聚脫氧核苷(dA)等人工同聚物作為引物，由于酶反應(yīng)與引物重合，使基質(zhì)不溶于三氯醋酸，可用玻璃纖維盤將其吸附，從未被放射性同位素標(biāo)記的反應(yīng)基質(zhì)中分離出反應(yīng)的生成物，并測定其放射活性?？鄢患右锼鶞y定的內(nèi)源性反應(yīng)所引起的放射活性之后，可測算酶的活性?！静牧稀?器材 試管、微量移液器、超速離心機、超聲波細胞破碎機、液體閃爍計數(shù)器等。 2試劑（1）淋巴細胞分離液（相對比密為1.077）。（2）3H或14C標(biāo)記的脫氧腺苷三磷酸等。（3）脫氧腺苷三磷酸。（4）多聚脫氧腺苷或低聚脫氧核苷(dA)。（5）二硫蘇糖醇(DTT)。（6）苯甲基磺酰氟化物(PMSF)。（7）TritonX-HCl（pH7.5）。（8）Whatman GF/C玻璃纖維盤。（9）吡咯啉酸。（10）乙醇。（11）乙醚。（12）甲苯系列閃爍液。（13）蔗糖-TKM緩沖液：250mmol/L蔗糖，50mmol/L三氯醋酸(TCA)pH7.4，25mmol/L氯化鉀，5mmol/L氯化鎂，5mmol/L DTT，lmmol/L PMSF，5ml/L TritonX-100?！痉椒ú襟E】1用蔗糖-TKM緩沖液提取末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，用d（PA）1218測定TdT活性。（1）提取粗酶液：在蔗糖-TKM中，加入經(jīng)淋巴細胞分離液分離的白血病細胞(末梢血或骨髓血)，使成11011個細胞/L的懸液，放在干冰-丙酮中，使之急劇凍融5次，將細胞破壞，或用安裝有微尖型探針的超聲波細胞破碎機，使細胞破壞后，在冰浴中振蕩15min，提取TdT，超速離心(70000r/min，60min)。取上清液作為粗酶液。（2）測定TdT活性：取粗酶液50l與測定TdT的基質(zhì)液50mmoI/L Tris-HCl pH7.5，30mmol/L氯化鉀，0.5mmol/L DTT，5mmol/L dGTP (含有poly DT 0.05U，3H-dGTP37kBq)各50l混合，37溫育20min后，置冰浴中使反應(yīng)停止。將一部分涂在 Whatman GF/C玻璃纖維盤上。立即將此盤放入冰冷的60mmoI/L TCA+0.05mol/L吡咯啉酸液中，振蕩15min，洗盤，再用30mmol/L TCA+0.025mol/L吡咯啉酸，沖洗2次，分別用乙醇及乙醚洗凈，使盤干燥。把干燥的盤放入液體閃爍計數(shù)器用的小玻瓶中，加甲苯系列的閃爍液，使吸附在玻璃纖維盤上的反應(yīng)生成物具有放射活性，再用液體閃爍計數(shù)器測定通常以mmol dGTP摻入1108個細胞來表示TdT活性，或用U/1108細胞表示(1U等于60min內(nèi)有l(wèi)nmol的dGTP)。2用0.25mol/L磷酸鉀(pH7.5)提取TdT，用d（PA）4060測定TdT活性，用含 lmmol/L 2-巰基乙醇(2-ME)的0.25mol/L磷酸緩沖液(pH7.5)，在緩沖液中細胞以11011/L左右的濃度懸浮，用超聲波破壞細胞(4次/15秒)，將其超速離心(70000r/min，60min)，所得上清液即是測定TdT活性的粗酶液?！咀⒁馐马棥?當(dāng)測定ALL的幼稚細胞等有極高活性的標(biāo)本時，即使使用粗酶液也能滿意地檢出其活性。當(dāng)測定TdT活性低的標(biāo)本時，由于在粗酶液中包含有蛋白酶，可能對TdT產(chǎn)生影響。此外，核酸酶的引物、反應(yīng)生成物及某些抑制物及內(nèi)源性引物等，均可能影響檢測結(jié)果。用磷酸纖維素柱及蔗糖密度梯度離心沉淀法沉淀，用部分酶提純進行測定時，可使這些問題在某種程度上得到解決。2為了從細胞中充分提取TdT，必須使用0.25mol/L的磷酸鉀緩沖液，因為高濃度的鹽可抑制TdT的活性。測定時應(yīng)將提取液稀釋5倍以上。為使粗酶液的鹽濃度下降而進行透析時，會導(dǎo)致TdT失活。3本試驗使用放射性試劑，試驗的整個過程應(yīng)避免放射性污染?！緟⒖挤秶?健康人骨髓細胞的活性為dGTP摻入1108個細胞的量為00.09mmol/L?！九R床意義】1ALL(T、B、非B型)可檢出較高的TdT活性，CML急性變時，約有1/3的病例在原始細胞中能檢出高的TdT活性。2惡性淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤的淋巴結(jié)細胞中可檢出較高的TdT活性。3TdT檢測在研究造血細胞的分化與白血病的關(guān)系、白血病細胞的起源、白血病的治療藥物選擇上都有重要的價值。 二、N-堿性磷酸酯酶檢測【目的】掌握N-堿性磷酸酯酶檢測的原理、方法、注意事項和臨床意義?！驹怼縉-堿性磷酸酯酶檢測（N-alkaline phosphatase assay）的原理是用P-硝基酚磷酸鹽(P-NPP)作為細胞堿性磷酸酯酶(APase)總活性檢測的基質(zhì)，在反應(yīng)中生成P-硝基酚，測量400nm時的光密度，借以檢測細胞N-APase的總活性。此外，可通過巰基乙胺-S-磷酸鹽（CASP）作為基質(zhì)來測定N-Apase的活性。通過酶反應(yīng)，生成半胱胺，用二硝基苯(DNTB)置換5-硫-硝基酚酸；測定412nm的吸光度，借以檢測N-APase的總活性。在基質(zhì)液中加入用N-丁醇水為13的混合液提取的粗酶液，室溫下放置60min，記錄酶反應(yīng)，求出酶反應(yīng)的速度。一般情況下，N-APase的P-NPP與CASP的水解速度之比(VP-NPP/VCASP)在1.12.0的范圍內(nèi)，平均為1.8。因此，N-APase的活性可用VP-NPP-1.8 VCASP求出，再從(VP-NPP-1.8 VCASP)/VP-NPP計算N-APase的百分率?！静牧稀?器材 試管、蒸餾設(shè)備、微量移液器、加熱設(shè)備、超速離心機、721型分光光度計等。2試劑（1）P-NPP。（2）三氯化磷(PCl3)。（3）無水氯化鋁。（4）硫磺粉末。（5）氫氧化鈉。（6）2-氨乙基氫溴化物。（7）N，N-二甲基甲酰胺。（8）甲醇。（9）乙醇?！痉椒ú襟E】1制備巰基乙氨-S-磷酸鹽（CASP）(1) 制備三氯硫化磷(PSCl3)：用蒸餾設(shè)備，加三氯化磷54.6ml，硫磺粉20.1g，加熱至4050，使之反應(yīng)。將反應(yīng)物三氯化磷用120125蒸餾收集。蒸餾過程中必須注意反應(yīng)物不能受潮。(2) 制備單純磷酸三鈉：氫氧化鈉40g溶于水300ml中，加三氯化磷17.5ml，用蒸餾水設(shè)備加熱至110115，15min以上，直到三氯硫化磷層消失為止。用冰水將其冷卻，用單硫磷酸三鈉與氯化鈉分層，過濾后收集，溶于4045水中，在上述溶液l00ml中，加無水甲醇185ml，使析出的單硫磷酸三鈉沉淀。反復(fù)進行此項操作后，加無水甲醇 200ml，攪拌1h，使之脫水，過濾。于100放置1h，使之干燥，密封保存在容器中。(3) 制備氫化巰基乙胺-S-磷酸鈉：硫代磷酸三鈉9.0g溶于蒸餾水50ml中，然后加2-氨乙基氫溴化物10.9g與N，N-二甲基酰胺25ml。充分?jǐn)嚢?0h。直至析出白色結(jié)晶，加乙醇300ml，使其在無水甲醇200ml中攪拌1h，得到結(jié)晶，在無水條件下真空干燥。2N-APase的測定(1)粗酶液的調(diào)配：檢測正常人粒細胞、淋巴細胞、白血病細胞或白血病細胞株培養(yǎng)的細胞時，取106108細胞，使之在0.1mol/L Tris-鹽酸溶液(pH8.0)lml中懸浮勻漿后超速離心(70000r/min，30min)，保留上清液。另用n-丁醇蒸餾水(0.31)提取小團塊，亦即在有小團塊的水溶液中，加n-丁醇，每5min用渦式混合器充分?jǐn)嚢枰淮危吋佣〈歼厰嚢?，?次。超速離心(70000r/min，30min)，取上清。用這兩種上清液測定N-Apase恬性。(2)測定N-APase活性：用基質(zhì)P-NPP測定：在含有作為基質(zhì)的1.0mmol/L P- NPP的0.5mol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)的基質(zhì)液中，加酶液100l，室溫下進行酶反應(yīng)60min。由于P-NPP水解，記錄400nm吸光度的變化，從直線部分計算反應(yīng)速度；用基質(zhì)CASP測定：在lmmol/L CASP，0.5mmol/L DNTB的0.5mmol/L Tris-鹽酸溶液(pH9.0)的基質(zhì)中，加酶液1001，室溫下放置60min。由于酶反應(yīng)，生成半胱胺，通過DNTB變換為5-硫-硝基酚酸，測定并記錄412nm處的吸光度，從直線部分計算反應(yīng)速度。N-APase的活性可按前述VP-NPP-1.8VCASP計算求出百分率?！咀⒁馐马棥?1 CASP尚無商品出售，須自行提純，而該方法頗為復(fù)雜，且CASP的純度對N-APase的活性有影響。2 因硫代磷酸三鈉及正磷酸鹽混入可抑制酶反應(yīng)，因此制備CASP時，務(wù)必將雜質(zhì)完全除去。3 以CASP作為基質(zhì)進行測定時，應(yīng)在比色杯上加蓋，以防止生成的半胱胺發(fā)生氧化反應(yīng)?！緟⒖挤秶?健康人粒細胞、淋巴細胞中不能檢出N-APase的活性。【臨床意義】 本試驗可用來檢測未成熟淋巴細胞的標(biāo)志。在AML及CML的慢性期、CML急粒變的原始粒細胞中，均不能檢出N-APase。但在ALL和CML急淋變的原始淋巴細胞中能檢出N-APase，且不僅在非T、非B-ALL的幼稚細胞，就是在T-ALL及具有B細胞標(biāo)記物的原始細胞中亦可檢出。因此認(rèn)為此酶是從未成熟的白血病性原始淋巴細胞向T細胞、B細胞分化過程中未成熟的淋巴系統(tǒng)的細胞標(biāo)志酶。此外，在鼻咽癌、喉癌的腫瘤細胞中，以及與EB病毒有關(guān)的傳染性單核細胞增多癥、Burkitt淋巴瘤等，都可檢出此酶。 三、酸性-醋酸酯酶檢測【目的】 掌握血細胞酸性-醋酸酯酶檢測的原理、方法、注意事項和臨床意義?！緦嶒炘怼?酸性-醋酸酯酶檢測(-acid naphthyl acetate esterase assay)，是利用血細胞中的酸性-醋酸萘酚酯酶(-acid naphthyl acetate esterase，ANAE)在弱酸性(pH 5.8)條件下能水解基質(zhì)液中的-醋酸萘酚，產(chǎn)生-萘酚，-萘酚再與六偶氮副品紅偶聯(lián)形成不溶性暗紅色偶氮副品紅萘酚沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)酶活性處?！静牧稀?器材 滴管、載玻片、37水浴箱、顯微鏡等。2試劑（1）固定液：40%甲醛溶液。（2）0.07mol/L PBS(pH7.6)：取磷酸氫二鉀溶液(磷酸二氫鉀0.93g溶于蒸餾水100ml中)13ml，加磷酸氫二鈉溶液(磷酸氫二鈉0.95g溶于蒸餾水100ml中)87ml，充分混合而成。（3）六偶