楓葉色素含量的季節(jié)變化測定實驗方案.docx

。楓葉色素含量的季節(jié)性變化測定實驗方案實驗原理：楓葉中的色素，當(dāng)葉子中所含的葉綠素占主導(dǎo)地位時，綠色就為主色調(diào)，抑制了其他色素展現(xiàn)本來面目。入秋后，氣溫逐漸下降，葉綠素的合成速度受阻，破壞卻與日俱增，到后來葉片中只剩下花青素、類胡蘿卜等色素，于是它們便有機(jī)會盡情展現(xiàn)自己的如花嬌顏。另外，隨著秋季不斷降溫，尤其是霜降之后，為適應(yīng)即將到來的寒冷氣候，葉肉內(nèi)積累了較多的糖分，這些糖分經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)，形成了花青素，也由此形成了秋葉變紅的重要基礎(chǔ)花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)的衍生物，廣泛存在于植物中的水溶性天然色素?；ㄇ嗨卦谧匀粻顟B(tài)下常與各種單糖形成糖苷，稱為花色苷。溶液PH不同，花色苷的存在形式也不同。對于一個給定的PH值，在花色苷的4種結(jié)構(gòu)之間存在著平衡：藍(lán)色的醌式（脫水）堿，紅色的花烊正離子，無色的甲醇假堿和查爾酮。花色苷在PH值很低時，其溶液呈現(xiàn)最強的紅色。隨著PH值的增大，花色苷的顏色將褪至無色，最后在高PH值時變成紫色或藍(lán)色。PH示差法測定花色苷含量的依據(jù)是花色苷發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是PH的函數(shù)，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨PH變化。因此在花青素最大吸收波長下確定兩個對花青苷吸光度差別最大但是對花色苷穩(wěn)定的PH值。根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗公式 花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 其中：DV-稀釋體積；VF-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm-平均消光系數(shù) 代入數(shù)值計算：葉綠素a.b: 葉綠素是由葉綠酸、葉綠醉和甲醇組成的二醇酷，是四毗咯衍生物， 其中的葉琳環(huán)是處于二氫形式，中心的金屬原子為鎂。蔬菜中的葉綠素有葉綠素a和葉綠素b兩類。葉綠素在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠素蛋白 質(zhì)，由多種葉綠素蛋白復(fù)合物構(gòu)成葉綠體，當(dāng)細(xì)胞死亡之后，葉綠素就游離出來。葉綠 素 是 一種不穩(wěn)定的物質(zhì).不耐光、熱、酸、不溶于水，易溶于堿、乙醉與乙醚，在堿性溶液中，皂化為葉綠素堿鹽。 葉綠素a、b在長波的最大吸收峰分別在663nm、645nm，據(jù)Lamber-Beer 定律，可得濃度C與光密度D間的關(guān)系式: D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (濃度單位：g/mL）葉綠素a的濃度：Ca= 12.72D663 2.59D645葉綠素b的濃度：Cb= 22.88D645 4.68 D663總?cè)~綠素的濃度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (濃度單位：mg/L）材料與用品：楓葉提取液，乙醇95%（AR），鹽酸 儀器：PHs-3B型酸度計，紫外分光光度計 丙酮、石英砂、碳酸鈣 分光光度計、天平、剪刀、研缽、移液管、漏斗、大試管實驗步驟：1. 花青素測定： 1，將花青素取液稀釋至一定的體積，用稀氫氧化鈉和稀鹽酸調(diào)節(jié)PH，觀察提取液在不同PH下的顏色變化。對提取液進(jìn)行200800nm全波長掃描，繪制光譜圖PH1.02.0原液4.59.5溶液顏色 2.測定波長的選擇 取楓葉花青素提取液用5%HCL-EtOH（15:85）溶液稀釋至一定體積，進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長。 紫外可見吸收光譜 3.PH示差法中PH的選擇 在選定PH時應(yīng)考慮以下因素：在此兩個PH處測定的花青素的吸收值差異應(yīng)是最顯著的；單一PH的輕微變動，對花青素吸光值的影響是極小的；花青素在所處的兩個PH下，應(yīng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。由于花青素只有在酸性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，因此只測定PH小于7條件下花青素吸光值的變化。PH為1.0時，花青素以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在PH為4.5時，花青素以無色的甲醇假堿的形式存在。因此選擇PH為1.0和4.5。 4.平衡時間的確定 因為花青素在溶液介質(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一PH下處于動態(tài)平衡，當(dāng)PH改變時，動態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢是PH降低時，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子移動；PH升高時平衡向藍(lán)色醌式移動。一定時間后達(dá)到一個新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須靜置一段時間，等動態(tài)平衡處于穩(wěn)定后，才能測定吸光值?；ㄇ嗨卦诰彌_液中的吸光度值與時間的變化關(guān)系（= nm）T（min）01020305080110PH1.0 bufferPH4.5 buffer 結(jié)果表明，花青素在緩沖液中的吸光度值隨時間變化，在PH1.0( )基本穩(wěn)定，在PH4.5時( )基本穩(wěn)定。所以綜合考慮，選擇平衡時間為 5.火棘果花青素含量的測定 移取濃縮液2ml，用5%HCL-EtOH稀釋、定容至100ml，分別移取10ml，用PH1.0和PH4.5的緩沖液稀釋至100ml，平衡（ ）min，在波長 處測定吸光值。根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗公式 花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 2.葉綠素a.b測定：稱1.25g葉用丙酮研磨勻漿過濾（用80%丙酮洗研缽及殘渣，合并濾液）濾液用80%丙酮定容至25mL適當(dāng)稀釋后測A645、A6631 取樣：稱取1.25g剪碎的葉片（提供的樣品即為剪碎后凍于-80的葉片）放入研缽中。注意取樣時要避開大的葉脈。2 研磨提?。合蜓欣徶屑尤?0%丙酮2.5ml，以及少許（約0.002g）CaCO3 (中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素) 和石英砂，研磨成勻漿，再加入3ml 80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處靜止35min后，用一層干濾紙過濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮將研缽洗凈，清洗液也要過濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的周圍洗脫色素，待濾紙和殘渣全部變白后，用80%丙酮定容至刻度。3 讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，注意不要用手接觸比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時要使清洗液接觸比色皿內(nèi)壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中，液面高度約為比色皿高度的4/5，將撒在比色皿外面的溶液用濾紙吸掉（注意不能擦），再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內(nèi)。第一個位置放盛有80%丙酮的比色皿，做為空白對照。將儀器波長分別調(diào)至663、645nm處，以80%丙酮做為空白對照調(diào)透光率100%，分別測定溶液在上述2個波長下的吸光度。每個樣品重復(fù)測定3次。注意，每次在轉(zhuǎn)換波長時，都要用80%丙酮調(diào)透光率100%。結(jié)果計算：根據(jù)Fuleki T經(jīng)驗公式 （1）花青素含量（mg/100g)=TO.D/(avE%1cm W 10); TO.D=ADVVF; A=A(pH1.0)-A(pH4.5). 其中：DV-稀釋體積；VF-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm-平均消光系數(shù) 代入數(shù)值計算：（2） D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (濃度單位：g/mL） 葉綠素a的濃度：Ca= 12.72D663 2.59D645葉綠素b的濃度：Cb= 22.88D645 4.68 D663總?cè)~綠素的濃度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (濃度單位：mg/L） 14級生物科學(xué) 植物生理學(xué)研究性實驗第二組 （ ）小組組員：黃志高（201407040