124例耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因突變特征分析.doc

124例耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因突變特征分析梁亞萍基金項(xiàng)目：陜西省衛(wèi)生科研項(xiàng)目（No.2014D9)窗體頂端作者簡介：梁亞萍，女，本科，副主任檢驗(yàn)師，主要從事結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷相關(guān)工作1 趙麗麗2 高漫1摘要：目的 對(duì)臨床分離的耐多藥結(jié)核分枝桿菌相關(guān)基因的突變特征進(jìn)行分析。方法 對(duì)124例耐多藥結(jié)核分枝桿菌和50株敏感株的耐藥相關(guān)基因（異煙肼inhA、 katG和oxyR-ahpC間隔區(qū);利福平rpoB ）進(jìn)行序列測定，分析其基因突變情況。結(jié)果 異煙肼耐藥inhA基因突變率為14.5%；katG基因突變率為70.2%（87/124），主要位于315位；oxyR-ahpC間隔區(qū)突變率為15.3% ；inhA、 katG兩種基因同時(shí)突變率75.0%，三種基因同時(shí)考慮突變率89.5%。利福平rpoB 基因突變的檢出率高達(dá)95.2%，突變主要發(fā)生在531、526、516位點(diǎn)。 結(jié)論 我省耐多藥菌異煙肼耐藥相關(guān)基因最常見突變?yōu)閗atG 315、inhA C-T（-15）、axyR-ahpC間隔區(qū)(-10) C-T，利福平為rpoB531、526、516。結(jié)合MDR-TB耐藥相關(guān)基因的特征分析，可以建立一種快速、準(zhǔn)確、特異的適合于我省的檢測結(jié)核耐多藥性的新方法。關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌 耐多藥 基因測序 突變Analysis of characteristics of genetic mutation of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis Liang Yaping11 Zhao Lili2 Gao Man1AbstractObjective: To analyze the mutation characteristics of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis related genes.Method:Resistant genes of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis and 50 sensitive strains (inhA,katG and oxyR-ahpC spacer of isoniazid;rpoB of rifampicin)were given sequence determination to analyze the gene mutation.Results:Gene mutation rate of inhA was 14.5%; gene mutation rate of KatG was 70.2% (87/124),mainly in the 315;gene mutation rate of oxyR-ahpC spacer was 15.3%;mutation rate of inhA, katG at the same time was 75.0%,mutation rate of the three genes at the same time was 89.5%.Gene mutation rate of rpoB of rifampicin was 95.2%,and mutation occurred mainly in the 531,526,516 sites.Conclusion:The most common mutation of multidrug-resistant isoniazid genes in our province were katG 315, inhA C-T (-15),oxyR-ahpC spacer (-10) C-T,and the rifampicin were rpoB531,526,516.The analysis of combining the feature of MDR-TB resistance related gene can establish a rapid, accurate, specific and suitable new method to detect multidrug-resistant tuberculosis.Key words: Mycobacterium tuberculosis ;Multidrug-resistant;Gene sequencing;Mutation【中圖分類號(hào)】：R52 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】： 【文章編號(hào)】： 我國的耐藥結(jié)核病流行情況較為嚴(yán)重，是全球27個(gè)耐藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，據(jù)全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查結(jié)果顯示1：我國肺結(jié)核病患者中耐多藥結(jié)核（MDR-TB，指結(jié)核分枝桿菌同時(shí)對(duì)異煙肼、利福平耐藥）耐藥率為8.32%。我省是結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)，耐多藥率高達(dá)10.2%2，MDR-TB的增多嚴(yán)重影響了結(jié)核病的化療效果，使患者治療費(fèi)用高治愈率低，死亡率高，已成為我省結(jié)核病控制的難題。結(jié)核分枝桿菌耐藥通常與某些基因突變有關(guān)，但不同地區(qū)的耐藥相關(guān)基因突變特征有所不同。本研究對(duì)我院來自我省各地的結(jié)核患者124株耐多藥結(jié)核分支桿菌進(jìn)行了耐多藥相關(guān)基因測序，異煙肼耐藥相關(guān)基因inhA、katG和axyR-ahpC,利福平耐藥基因ropB，分析我省耐多藥基因的突變特征，從而建立一種快速、準(zhǔn)確、特異的適合于我省的檢測結(jié)核耐多藥的新方法。1 材料和方法1.1 標(biāo)本來源：本研究菌株是收集本院2014年8月-2015年2月來自于我省陜北、陜南以及關(guān)中結(jié)核患者的174株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，其中124株耐多藥菌株和50株敏感菌株。1.2 藥敏試驗(yàn):采用美國BD公司的BACTEC MGIT 960行利福平、異煙肼快速藥敏實(shí)驗(yàn)，藥物濃度及操作過程嚴(yán)格按照MGITTM Procedure Manual要求進(jìn)行3。1.3 DNA模板的制備：采用CTAB法4提取結(jié)核分枝桿菌DNA。1.4 PCR擴(kuò)增及序列測定：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物序列見表1，采用50ul反應(yīng)體系。反應(yīng)參數(shù)：95預(yù)變性5min；95 變性40s，64退火40s，72延伸1min,35個(gè)循環(huán)，然后72延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。表1.PCR反應(yīng)引物及目標(biāo)片段位置 基因 引物名稱 引物序列（5-3） 位置 片段大?。╞p) inhA inh A-F TGC CCA GAA AGG GAT CCG TCA TC 16732781673732 455 inh A-R ATC AGG AAT GCG TCC GCG GA katG katG-F AAC GAC GTC GAA ACA GCG GC 21548862155340 455 kat G-R GCG AAC TCG TCG GCC AAT TC oxyR-ahpC oxyR-ahpC-F GAG ACC GGC TTC CGA CCA CC 27259432726235 293 oxyR-ahpC-R GCT GGT AGG CGG GGA ATT GAT rpoB rpoB-F CTT GCA CGA GGG TCA GAC CA 760829761371 543 rpoB-R ATC TCG TCG CTA ACC ACG CC1.5 PCR序列分析：以H37RV作陰性對(duì)照,使用個(gè)性化perl腳本對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。2 結(jié)果2.1異煙肼主要耐藥相關(guān)基因突變分析 異煙肼耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因inhA、 katG和oxyR-ahpC間隔區(qū)檢測后顯示，在124株耐多藥菌株中18株inhA基因突變，主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū),其中12株發(fā)生 C-T（-15）突變,4株 發(fā)生 T-C （-8) 突變和2株其他區(qū)突變，這些菌中還有12株聯(lián)合 katG突變；87株發(fā)生了 katG基因突變,均為單個(gè)點(diǎn)突變,其中82 株為 katG315突變，5株聯(lián)合了oxyR-ahpC間隔區(qū)的突變；19株 axyR-ahpC間隔區(qū)發(fā)生的突變，主要發(fā)生在(-10) C-T有6株,還有一些其他突變，5株聯(lián)合 katG突變。2.2 利福平主要耐藥相關(guān)基因突變分析 利福平耐藥分子機(jī)制比較明確，主要由rpoB 基因突變引起，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增了543bp相關(guān)片段，包含了81bp耐藥決定區(qū)，即密碼子507-533區(qū)。124株耐多藥菌中，118株發(fā)生了rpoB 基因突變，其中99株為點(diǎn)突變，19株聯(lián)合突變，這些突變位點(diǎn)主要位于利福平耐藥決定區(qū)，最多的是531位點(diǎn)突變62株，其次526位突變29株，516位點(diǎn)為14株。另外50株敏感菌在異煙肼、利福平擴(kuò)增區(qū)未檢出突變。 3 討論利福平、異煙肼是抗結(jié)核一線主要藥物，在結(jié)核病的治療中起著重要作用，MDR-TB是當(dāng)今結(jié)核病化療失敗的重要因素之一，并被廣泛重視，耐多藥結(jié)核病的控制關(guān)鍵在于早期選擇敏感藥物聯(lián)合治療5。目前用BACTEC MGIT 960檢測結(jié)核菌藥物敏感性，前提是培養(yǎng)陽性才能進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，總共需花費(fèi)23天左右時(shí)間6，臨床醫(yī)生對(duì)于沒有藥敏結(jié)果的這種病例，只能通過經(jīng)驗(yàn)用藥，難以滿足臨床需要，所以一種快速、簡便的耐多藥檢測方法對(duì)于病人的及時(shí)有效的治療極為重要。已有研究表明7-9,利福平和異煙肼耐藥性的產(chǎn)生主要與rpo B、kat G、inh A基因的突變有關(guān)，但由于結(jié)核分枝桿菌在生長過程中受到各種因素的影響,在不同地區(qū)其突變類型和頻率還是存在差異性。研究我省主要基因突變發(fā)生的特征,可為今后建立敏感、快速和特異的耐藥診斷技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。 其中異煙肼耐藥機(jī)制相對(duì)較為復(fù)雜，本次研究對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因inhA、 katG和oxyR-ahpC間隔區(qū)的分子特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：124例耐多藥菌中inhA基因突變的檢出率為14.5%（18/124）；katG基因突變率為70.2%（87/124），而且katG基因突變高度集中，主要位于315位點(diǎn)，占katG基因突變的94.2%（82/87),315位點(diǎn)密碼子由AGC突變成ACC，絲氨酸變?yōu)樘K氨酸,；oxyR-ahpC間隔區(qū)突變率為15.3%（19/124）。inhA、 katG兩種基因突變同時(shí)檢出率75.0%（93/124），三種基因檢出率86.3%（107/124），這與中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道基本一致10。 利福平耐藥主要由rpoB 基因突變引起，本院124例利福平耐藥的菌株中，118株發(fā)生突變，rpoB 基因突變的檢出率高達(dá)95.2%（118/124）。118例耐藥菌中，突變主要發(fā)生在 rpoB 531檢出率52.5%(62/118),531位密碼子由TCG突變?yōu)門TG，絲氨酸變?yōu)榱涟彼?；rpoB 526檢出率 24.6%（ 29/118 ）；rpoB 516 檢出率11.9%（14/118）位點(diǎn)，rpoB531、526、516占全部rpoB基因突變的89.0%（105/118），這與陳燕、Yuan X及國外學(xué)者報(bào)道一致11-13，說明通過檢測rpoB基因突變來檢測利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥的可靠性很高，另外還有6株未檢測出rpoB突變的耐藥菌，可能是其他基因突變引起。通過對(duì)我省MDR-TB耐藥相關(guān)基因的特征分析，說明異煙肼oxyR-ahpC間隔區(qū)突變?cè)谖沂∧投嗨幘幸草^常見，增加oxyR-ahpC間隔區(qū)的檢測，可提高基因突變的檢出率，僅考慮inhA、 katG兩個(gè)基因會(huì)對(duì)MDR-TB漏檢，影響耐多藥患者治療。綜上所述，對(duì)異煙肼從katG 315、inhA C-T（-15）、axyR-ahpC間隔區(qū)(-10) C-T這三個(gè)基因，利福平的rpoB531、526、516考慮建立一種快速、準(zhǔn)確、特異的適合于我省的檢測耐多藥結(jié)核的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)我省醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的進(jìn)步以及結(jié)核病的控制具有積極促進(jìn)作用和意義。參考文獻(xiàn)1 中華人民共和國全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告（2007-2008）R.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.2 鄒遠(yuǎn)嫵，王婷，楊莉,等.431例復(fù)治患者結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線抗結(jié)核病藥物耐藥分J.臨床肺科雜志,2014，19(9):1729-1730.3 梁亞萍，高漫.BACTEC MGIT 960用于結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的初步評(píng)價(jià)J.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011,12（6）:521-522.4 Somerville W,Thibert L,Schwartzman K,et al.Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA:a question of containmentJ.J Clin Microbiol,2005,43(6):2996-2997. 5 鄧海清,陳保文,楊蕾,等.結(jié)核病藥效評(píng)價(jià)用結(jié)核分枝桿菌參考菌株的篩選J.中國生物制品學(xué)雜志,2015,28(02):160-166.6 張娟,蔣俊,張紅.MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)中的比對(duì)分析J.中國防癆雜志，2011,33（06）:361-364.7 Zhang Z,Lu J,Wang Y. Prevalence and molecular characterization of fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in ChinaJ.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,2014,58(01):127-130.8 Campbell PJ ,Morlock GP ,Sikes RD ,et al.Molecuiar detection of mutations accociated with first-and second-line drug resistance compared with conventional drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosisJ.Antimicrob Agents Ch,2011.55(5):2032-2041.9孫明潔,張江峰,張亞麗,等.結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥株rpoB基因突變特征研究J.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2014