銅脅迫對(duì)紅豆幼苗生理生化指標(biāo)的毒害作用.doc

銅脅迫對(duì)紅豆幼苗生理生化指標(biāo)的毒害作用李沁 楊唐惠子 楊瑤南京師范大學(xué)教師教育學(xué)院12級(jí)生物師范 南京 江蘇 210023摘要：用施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同銅離子濃度溶液的方法研究了銅離子對(duì)紅豆幼苗生長(zhǎng)的影響及測(cè)定植物體內(nèi)生理生化指標(biāo)的情況。結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)的銅離子范圍內(nèi)，銅離子濃度越高，葉綠素含量減少，抑制了紅豆幼苗根與株高的伸長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)MDA、POD、可溶性糖的生成有促進(jìn)作用。關(guān)鍵詞：紅豆幼苗；銅；銅吸收銅是植物生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)植物生長(zhǎng)有著重要的作用，但過量的銅會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，使植物的水分代謝、光合作用、呼吸作用等各項(xiàng)生理代謝發(fā)生紊亂，使植物生長(zhǎng)緩慢。紅豆幼苗遭到銅離子污染后，嚴(yán)重影響紅豆的生長(zhǎng)發(fā)育。本次實(shí)驗(yàn)通過用施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同銅離子濃度溶液的方法研究了銅離子對(duì)紅豆幼苗生長(zhǎng)的影響及測(cè)定植物體內(nèi)生理生化指標(biāo)的情況，并初步探討了植物對(duì)銅離子的適應(yīng)性機(jī)理。1、 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1、實(shí)驗(yàn)材料：紅豆幼苗1.2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)：當(dāng)紅豆幼苗長(zhǎng)出真葉的時(shí)候施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同銅離子濃度溶液，7天后實(shí)驗(yàn)紅豆生理生化指標(biāo)。1.3、葉綠素含量及其胡蘿卜素含量測(cè)定1.3.1、提?。喝~片去除中脈，洗凈、吸干、稱取0.3g左右，記錄重量后于研缽中加入5mL 80%丙酮、少許石英砂和碳酸鈣，研磨勻漿后過濾，再用5mL 80%丙酮沖洗濾渣，混勻，濾渣應(yīng)該接近灰白色。如果仍偏綠，需要將濾液倒回漏斗再次過濾。用量筒量濾液體積。 1.3.2、測(cè)定：以80%丙酮調(diào)零，測(cè)定葉綠素提取液在645nm、663nm和470nm處的光吸收值。1.3.3、計(jì)算：葉綠素a：C=12.21A 663 -2.81A 645葉綠素b：C=20.13A 645 -5.03A 663葉綠素a/葉綠素b=?1.4、植株高度測(cè)定：將植株從盆中取出，洗凈蛭石后測(cè)量莖高，同濃度Cu2+處理的植株莖高取平均，比較不同濃度Cu2+處理對(duì)植株莖生長(zhǎng)的影響。1.5、植株根長(zhǎng)：將植株從盆中取出，洗凈蛭石后測(cè)量主根長(zhǎng)度，同濃度Cu2+處理的植株主根長(zhǎng)度取平均，比較不同濃度Cu2+處理對(duì)植株根生長(zhǎng)的影響。1.6、MDA及其可溶性糖的測(cè)定1.6.1、MDA的提?。悍Q取剪碎的試材0,3g，加入2ml l0TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mlTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在4000rmin-1離心10min，上清液為樣品提取液。1.6.2、顯色反應(yīng)和測(cè)定：吸取離心的上清液2ml(對(duì)照加2ml蒸餾水)，加入2ml 06TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min（自有小氣泡產(chǎn)生后計(jì)時(shí)），自來水迅速冷卻后再離心（4000g）10min。取上清液測(cè)定532、600和450nm波長(zhǎng)下的消光度。1.6.3、計(jì)算含量MDA濃度(mol / L) 6.45（A532A600） 0.56A450MDA含量mol(g FW) c(MDA濃度) x V（提取液體積mL）x 10-3 / (g FW) (植物組織鮮重)可溶性糖的濃度(mmol/L)1171A4501.7、POD測(cè)定：1.7.1、配制反應(yīng)液：0.1mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0） 50ml +愈創(chuàng)木酚 28uL +H2O2(30%) 19uL（將磷酸緩沖液水浴加熱，加入愈創(chuàng)木酚并不斷搖勻，完全溶解后冷卻、加入H2O2。一般臨用前配制，冰箱內(nèi)短期保存。）1.7.2、提取酶液：葉片0.5g + pH6.0磷酸緩沖液5mL（預(yù)冷）冰浴研磨，轉(zhuǎn)入離心管，離心（4000rpm 15min），上清液定容至10mL，即為粗酶液。1.7.3、測(cè)定：波長(zhǎng)調(diào)至470nm預(yù)熱，以3mL 反應(yīng)液+ 0.2mL 提取液調(diào)零。3mL反應(yīng)液+0.2mL粗酶液，震蕩混勻并立刻記時(shí)，測(cè)OD470，30S內(nèi)讀第一次數(shù)，之后每10S讀數(shù)一次，至OD值3.000。（如酶反應(yīng)速度太快，可用提取液稀釋后再測(cè)）1.7.4、計(jì)算：選取OD值變化較均勻的一段數(shù)據(jù)，代入公式計(jì)算；以每分鐘OD值變化0.01作為1個(gè)酶活力單位（U）。過氧化物酶活性U/(gFWmin)=A470（VT/WVS0.01t）2、 原始數(shù)據(jù)的處理2.1、紅豆幼苗根長(zhǎng)測(cè)定（表1）銅離子濃度（mg/L）0103050編號(hào)118.500013.500016.000015.5000編號(hào)216.000016.500015.50009.5000編號(hào)311.000015.500017.500013.5000編號(hào)417.000015.500017.500015.0000編號(hào)517.000018.000014.500015.3000編號(hào)620.500015.500010.000011.5000平均值（cm）16.666715.750015.166713.38332.2、紅豆幼苗株高測(cè)定（表2）銅離子濃度（mg/L）0103050平均值（cm）25.423.220.715.22.3、光合色素含量測(cè)定（表3）OD663 OD645 OD470 CaCbCA/CBCX1.9390 0.8790 1.7130 22.2608 11.0546 2.0137 1.6618 1.4450 0.6630 1.3140 16.5680 8.4201 1.9677 1.3067 0.7760 0.3720 0.7250 8.8545 4.8871 1.8118 0.6111 0.3920 0.2060 0.4150 4.4243 2.8828 1.5347 0.3155 2.4、過氧化物酶含量測(cè)定（表4）銅離子濃度（mg/L）0103050質(zhì)量（g）0.29080.29520.29880.298530s（OD470）0.0590.0860.1020.14740s（OD470）0.0810.1150.1350.18250s（OD470）0.1040.1420.1650.21660s（OD470）0.1220.1680.1940.24970s（OD470）0.1420.1940.2210.28480s（OD470）0.1640.2170.2460.31990s（OD470）0.1870.2350.2840.348過氧化物酶4401.65065047.42546091.03076733.66832.5、MDA及其可溶性糖含量測(cè)定（表5）銅離子濃度（mg/L）OD600OD532OD450可溶性糖濃度MDA濃度500.07100.20400.51205.99550.5711300.06500.19000.43705.11730.5615100.04900.16100.37504.39130.512400.03300.13900.33403.91110.49673、結(jié)果與分析3.1、銅離子濃度對(duì)紅豆幼苗根長(zhǎng)的影響3.1.1、根系是直接受重金屬毒害的器官。在實(shí)驗(yàn)培條件下，紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后根系凈伸長(zhǎng)量見圖1。紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后株高伸長(zhǎng)量見圖2。3.1.2、結(jié)果分析：Cu2+對(duì)紅豆植株的株高和根長(zhǎng)的作用有一致性，植株的高度和根長(zhǎng)與Cu2+的濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，均為抑制作用。隨著Cu2+ 濃度的增加，下降趨勢(shì)增加。濃度為10mg/L時(shí)，根長(zhǎng)下降了5.50%，株高下降了8.66%，而濃度為50mg/L時(shí)，根長(zhǎng)下降了19.70%，株高下降了40.16%，下降十分明顯。株高降低的原因主要在于銅使植株老葉枯黃萎蔫，同時(shí)又抑制新葉的正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)受到限制。而銅在根部的積累抑制根系生長(zhǎng)，養(yǎng)分吸收能力下降，同時(shí)也導(dǎo)致了株高的降低。3.2、銅離子濃度對(duì)光和色素含量的影響3.2.1、在實(shí)驗(yàn)培條件下，紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后葉綠素含量的變化見圖3、CA/CB的變化趨勢(shì)見圖7、胡蘿卜素含量的變化見圖8。3.2.2、結(jié)果分析：當(dāng)培養(yǎng)的對(duì)照組與染毒組所有幼苗到第7d時(shí)，測(cè)定各組葉綠素含量，結(jié)果見表3.由表3可知，幼苗葉綠素與胡蘿卜素含量隨溶液中Cu2+增大而減小,尤其是胡蘿卜素的變化更顯著Cu2+ 的濃度為10mg/L時(shí)的胡蘿卜素濃度為不脅迫的濃度的78.63%，而當(dāng)Cu2+濃度增加到50mg/L時(shí)，胡蘿卜素濃度僅為不添加Cu2+的18.98%，急劇下降；葉綠素a/b值也隨著染毒濃度的不斷增加而減小，且對(duì)外界重金屬脅迫反應(yīng)比較敏感，這是由于重金屬首先破壞葉綠素a的緣故。Cu2+對(duì)植物葉綠素的破壞作用，這可能與葉綠素的合成與分解代謝過程受到影響有關(guān)。一方面，Cu2+進(jìn)入植物伴內(nèi)使葉綠素酶活性比倒失調(diào)致使C葉綠素分解加快，另一方面，由于銅局部積累過多，與葉綠體中蛋白質(zhì)的-SH結(jié)合或取代其中Fe2+、Zn2+、Mg2+，使得葉綠體蛋白質(zhì)中心離子組成發(fā)生變化，破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)和功能，此外高銅抑制根系生長(zhǎng)，養(yǎng)分吸收能力下降，造成鐵缺乏，同樣導(dǎo)致葉綠素合成降低。Cu2+對(duì)植物幼苗生理功能的破壞程度取決于對(duì)光和色素的破壞，進(jìn)而影響到植物賴以生存的光合作用過程，最終的結(jié)果是由于光合作用效率的下降使植物體的其他生理功能受到連鎖抑制效應(yīng)，導(dǎo)致植物體代謝衰竭而死亡。3.3、銅離子濃度對(duì)POD含量的影響3.3.1、在實(shí)驗(yàn)培條件下，紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后POD變化見圖4。3.3.2、結(jié)果分析：POD廣泛分布于植物各組織器官，是植物體內(nèi)清除自由基最關(guān)鍵的保護(hù)酶之一，清除體內(nèi)自由基，以避免自由基積累對(duì)生物膜造成破壞。在銅離子的脅迫下，POD活性變化劇烈。Cu2+濃度為10mg/L，POD濃度增加了14.67%， Cu2+濃度為30mg/L，POD濃度比濃度為10mg/L增加了20.68%，而Cu2+濃度為50mg/L比30mg/L，POD濃度值增長(zhǎng)了10.55%，增長(zhǎng)幅值略微減小。但無論增長(zhǎng)幅值大小，紅豆POD濃度與Cu2+濃度都呈正相關(guān)。銅脅迫下，POD活性急劇增強(qiáng)，可能是由于銅過剩，引起H202急劇增加，刺激POD活性上升。3.4、銅離子濃度對(duì)MDA含量的影響3.4.1、在實(shí)驗(yàn)培條件下，紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后MDA含量變化見圖5。3.4.2、結(jié)果分析：MDA 是植物逆境條件下產(chǎn)生的一種過氧化產(chǎn)物, 可與蛋白質(zhì)、 核酸、 氨基酸等活性物質(zhì)交聯(lián), 形成不溶性的化合物 ( 脂褐素 ) 沉積 , 從而干擾細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，因此被作為反映植物抗逆性強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。銅脅迫也會(huì)加重膜脂的過氧化作用, 從而使 MDA 含量增加。圖 5 顯示, 增加環(huán)境中銅的濃度將明顯提高小麥葉片中 MDA 的含量。特別在環(huán)境中的 Cu 2+ 濃度由10mg/L增至30mg/L時(shí),MDA 的含量迅速提高9.59%。3.5、銅離子濃度對(duì)可溶性糖含量的影響3.5.1、在實(shí)驗(yàn)培條件下，紅豆幼苗用不同濃度Cu2+處理后可溶性糖含量變化見圖6。3.5.2、結(jié)果分析：在營(yíng)養(yǎng)液中添加0一50mgL Cu2+，紅豆體內(nèi)可溶性糖濃度的變化如表5及圖6所示，隨著銅離子濃度的增加，紅豆體內(nèi)的可溶性糖也平穩(wěn)上升?？扇苄蕴鞘且环N主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在強(qiáng)度不是太大的脅迫條件下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高，可提高細(xì)胞液濃度，降低其滲透勢(shì)，是一種對(duì)外界脅迫的適應(yīng)調(diào)節(jié)。適當(dāng)濃度銅處理時(shí)可溶性糖增加，可能是體內(nèi)高分子碳水化合物如淀粉分解加強(qiáng)，而合成受抑，光合產(chǎn)物形成過程中，直接轉(zhuǎn)向形成低分子量物質(zhì)如蔗糖等。4、 實(shí)驗(yàn)總結(jié) 銅脅迫下，紅豆生長(zhǎng)受到抑制，使得生物量降低，從本實(shí)驗(yàn)來看，其生物量降低的機(jī)理體現(xiàn)在以下五個(gè)方面： 植物根系是活躍的吸收器官和合成器官, 它直接影響植物地上部的生長(zhǎng)狀況。銅在根部的積累影響根系的正常生長(zhǎng)，甚至傷害紅豆根系，導(dǎo)致根系活力下降，吸收機(jī)能受到干擾，水分和養(yǎng)分吸收不平衡，影響植株的正常生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而使紅豆植株變矮，根長(zhǎng)變短。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 營(yíng)養(yǎng)液中的銅一定濃度會(huì)降低小麥葉片的葉綠素含量, 這可能與葉綠素的合成與分解有關(guān)。一方面, 銅進(jìn)入植物體內(nèi)可使葉綠素酶活性比例失調(diào), 致使葉綠素分解加快 ; 另一方面, 由于銅局部積累過多, 與葉綠素中蛋白質(zhì)的- SH 結(jié)合或取代Fe 2+ 、Zn 2+ 、 Mg 2+ 等, 使得葉綠素蛋白中心離子組成發(fā)生變化, 破壞了葉綠素的結(jié)構(gòu)和功能。此外, 銅脅迫通過抑制根系生長(zhǎng), 使根系的養(yǎng)分吸收能力下降, 造成鐵缺乏, 也會(huì)導(dǎo)致葉綠素的合成降低。 MDA 是膜脂過氧化的末端產(chǎn)物, 人們常用其含量的高低作為判斷膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中, 銅的過量脅迫使小麥葉片和根系的 MDA 相對(duì)含量明顯增加, 證明了銅處理的細(xì)胞膜透性的增加確實(shí)是由于銅對(duì)細(xì)胞膜的傷害所造成。在正常情況下, 植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡, 而當(dāng)植物一旦處于重金屬銅脅迫下, 這種平衡遭到破壞, 導(dǎo)致了 O 2- 、OH - 等自由基大量累積, 自由基啟動(dòng)膜脂過氧化作用, 膜內(nèi)擬脂雙分子層中含有的不飽和脂肪酸鏈被過氧化分解, 從而造成膜的損傷和破壞,