「細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介【學(xué)習(xí)資料】」.ppt

基因轉(zhuǎn)染 1 學(xué)習(xí)資料 報(bào)告內(nèi)容 一轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介二轉(zhuǎn)染的分類三轉(zhuǎn)染的方法四轉(zhuǎn)染后篩選 2 學(xué)習(xí)資料 一 轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介 1 基因轉(zhuǎn)染 將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能 2 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究 3 學(xué)習(xí)資料 二 轉(zhuǎn)染的分類 4 學(xué)習(xí)資料 三 轉(zhuǎn)染的方法 基因轉(zhuǎn)染的基本方法可以分為 1 重組子的構(gòu)建 2 基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法 5 學(xué)習(xí)資料 重組子的構(gòu)建 1 目的基因的制備和獲取2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇3 DNA片斷的重組連接4 DNA重組體的鑒定 6 學(xué)習(xí)資料 1 目的基因的制備和獲取 1 目的基因是所要研究或應(yīng)用的基因 也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段 2 目的基因常用的制備方法 7 學(xué)習(xí)資料 A 限制酶切除a 從原核基因組DNA制備 視原核基因組物理圖譜已知或未知 克隆方法不同 b 從真核基因組DNA制備c 從已克隆的DNA片段制備 8 學(xué)習(xí)資料 B PCR或RT PCR方法制備目的基因a 獲取已知基因據(jù)已發(fā)表的基因序列 或基因兩側(cè)序列已知 設(shè)計(jì) 合成一對(duì)引物 PCR 基因組DNA為模板 RT PCR mRNA為模板 從組織或細(xì)胞制備目的基因b 構(gòu)建RT PCR文庫(kù)法獲取未知基因據(jù)mRNA末端如polyA尾設(shè)計(jì)共同引物 將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNA 插入適當(dāng)載體 構(gòu)成PCR cDNA文庫(kù)篩選 9 學(xué)習(xí)資料 C 計(jì)算機(jī)克隆 即利用GenBank信息 利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物 嘗試獲取未知基因片段 這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用 D 化學(xué)合成法制備基因片段 用DNA合成儀 對(duì)目的基因分段合成 連接 可以得到所需的目的基因 10 學(xué)習(xí)資料 2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類 質(zhì)粒型載體和病毒型載體 1 質(zhì)粒型載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過(guò)細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的 主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列 A 典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件 a 啟動(dòng)子b 增強(qiáng)子c 多聚腺苷酸化信號(hào)d 藥物選擇標(biāo)記基e 報(bào)告基因f 表位標(biāo)簽 11 學(xué)習(xí)資料 B 常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體a pcDNA3 lb pSIc pCMV HAd pBudCE4 1e pTRE 12 學(xué)習(xí)資料 2 病毒型載體病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因 這類載體將來(lái)在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值 目前應(yīng)用的病毒類型包括 逆轉(zhuǎn)錄病毒 腺病毒 牛痘病毒和桿狀病毒等 A 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是 可以使外源基因整合到基因組中 因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá) 但是 由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的 因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu) 尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常 13 學(xué)習(xí)資料 B 腺病毒載體易于培養(yǎng) 純化 在感染過(guò)程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶 可插入較大的外源基因片段 且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合 是研究真核基因的良好模型 14 學(xué)習(xí)資料 3 DNA片斷的重組連接 15 學(xué)習(xí)資料 4 DNA重組體的鑒定 外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子 而插入片斷大小 是否突變及插入位置 順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增 我們所需要的基因或表達(dá) 表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品 所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體 1 酶切鑒定是必需的 基于下述 A 限制性圖譜個(gè)體特異性 不同的載體或DNA分子物理圖譜不同 酶切后片段大小不一樣 電泳圖譜不一樣 B 同一載體連接不同的DNA片斷 不同的載體連接同一片段 片段上也有位點(diǎn) 酶切圖譜是不同的 16 學(xué)習(xí)資料 C 插入法 單酶單切點(diǎn) 或替代法 雙酶雙位點(diǎn) 酶切 一般來(lái)說(shuō)用3種限制酶切 可鑒定載體及 插入片段的大小 方向 切后并電泳分析 以確定是否得到預(yù)期的rDNA 2 若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因 可進(jìn)行在序列測(cè)定 3 若構(gòu)建表達(dá)載體 可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定 17 學(xué)習(xí)資料 基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法 18 學(xué)習(xí)資料 1 DEAE 葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一 DEAE 葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體 它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取 DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開始 但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠 19 學(xué)習(xí)資料 2 磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法由于試劑易得 價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究 方法是 先將DNA和氯化鈣混合 然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀 后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上 通過(guò)胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA 20 學(xué)習(xí)資料 3 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 目前應(yīng)用最廣泛 原理 陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合后 形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物 DNA被包在脂質(zhì)體中間 這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中 脂質(zhì)體粘附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合 DNA被釋放到胞漿中 21 學(xué)習(xí)資料 此圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖 它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程 22 學(xué)習(xí)資料 主要應(yīng)用 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特點(diǎn) 使用方法簡(jiǎn)單 可攜帶大片段DNA 通用于各種類型的裸露DNA或RNA 能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞 沒有免疫原性 雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率 但在體內(nèi) 能被血清清除 并在肺組織內(nèi)累積 誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng) 導(dǎo)致高水平的毒性 很大程度上應(yīng)用受限制 23 學(xué)習(xí)資料 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性 因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例 細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題 通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用 24 學(xué)習(xí)資料 此圖為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后熒光蛋白的表達(dá) 25 學(xué)習(xí)資料 物理方法 包括電穿孔 顯微注射及基因槍等方法 1 電穿孔法利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾 使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔 電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可方便地用于懸浮細(xì)胞 重現(xiàn)性好 但需要較多的細(xì)胞 影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間 必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn) 26 學(xué)習(xí)資料 2 顯微注射法該法雖然費(fèi)力 但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法 這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究 3 基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi) 這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞 27 學(xué)習(xí)資料 病毒顆粒是一類十分有效的基因釋放系統(tǒng) 因此 它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的方法 病毒感染具有高效率 可穩(wěn)定遺傳 適用于各種不同來(lái)源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn) 但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性 操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施 1 逆轉(zhuǎn)錄病毒 2 腺病毒 28 學(xué)習(xí)資料 四轉(zhuǎn)染后篩選 篩選所選用的抗生素跟轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒上所帶的真核篩選抗性基因有關(guān)的 標(biāo)有neo 實(shí)際上應(yīng)該是neoresistance 的載體 指載有降解新霉素的基因 新霉素作用于原核和真核細(xì)胞 對(duì)兩者都有殺傷作用 用于轉(zhuǎn)染后 穩(wěn)定表達(dá)外源基因細(xì)胞的陽(yáng)性篩選 29 學(xué)習(xí)資料 標(biāo)有amp 實(shí)際上應(yīng)該是ampresistance 的載體 指載有降解氨芐青霉素的基因 內(nèi)酰胺酶 作用于原核細(xì)胞 只對(duì)敏感菌有作用 用于克隆菌的篩選 最常見的載體上帶有新霉素抗性基因neo 所以篩選的時(shí)候用G418 G418是目前獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)最常用的試劑之一 30 學(xué)習(xí)資料 G418是一種氨基糖苷類抗生素 其結(jié)構(gòu)與新霉素 慶大霉素 卡那霉素相似 通過(guò)影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成 對(duì)原核和真核細(xì)胞等都有毒性 包括細(xì)菌 酵母 植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 也包括原生動(dòng)物和蠕蟲 細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列 neo抗性基因 攜帶的氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無(wú)毒性狀 31 學(xué)習(xí)資料 當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后 則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA 從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá) 使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 目前G418的這一特性已在基因轉(zhuǎn)移 敲除 抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用 32 學(xué)習(xí)資料 轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多 如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型 對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此 需要被轉(zhuǎn)染的分子 DNA RNA 寡核苷酸 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)染試劑等 但無(wú)論在何種情況下 轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率 低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素 33 學(xué)習(xí)資料 1細(xì)胞 1 分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞 2 貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞 3 傳代次數(shù) 4 細(xì)胞數(shù)量 融合率 34 學(xué)習(xí)資料 2交叉污染如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞 那就有可能發(fā)生交叉污染 即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生 如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染 和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn) 如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種 幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物 35 學(xué)習(xí)資料 3載體DNA一般原則 對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定 確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系 在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí) 一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照 1 載體完整性 2 載體制備物 36 學(xué)習(xí)資料 4組織培養(yǎng)試劑一般原則 優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件 只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑 并盡可能減少所用試劑的變更 1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 胎牛血清 3 添加劑 37 學(xué)習(xí)資料 5轉(zhuǎn)染方案一般原則 建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案