細胞毒生產(chǎn)工藝課件.docx

細胞毒活疫苗（滅活疫苗）生產(chǎn)工藝課件豪威生物科技有限公司主講人 喬云龍細胞苗工藝流程圖一、 種毒二、 細胞 1、原代細胞：牛睪丸細胞、雞成纖維細胞、羊睪丸細胞2、 傳代細胞：wero非洲綠猴腎細胞、MDCK狗腎、DF-1雞胚成纖維細胞、BHK-21幼倉鼠腎細胞、ST豬睪丸細胞、PK-15豬腎上皮細胞、Marc145猴腎細胞。三、細胞培養(yǎng)液主要成分氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位.不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸.其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡.因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺.但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi).已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺.碳水化合物碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分.主要有葡萄糖，核糖，脫氧核糖，丙酮酸鈉和醋酸等.無機鹽培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡.此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能.培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素，細胞通?？赡褪?60mOsm/kg 320 mOsm/kg.標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動.特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質(zhì).緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是，細胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同.成纖維細胞喜歡較高pH （7.4 - 7.7），而傳代轉化細胞系則需要偏酸pH （7.0 - 7.4）.由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2體系進行緩沖，因此，氣相中的CO2濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡.如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設定在5%，培養(yǎng)3液中NaHCO3的加入量為1.97g/L；如果CO2濃度維持在10%，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為3.95g/L.細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換. HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力,但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒.HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加.在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中.大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色.磷酸緩沖液磷酸鹽緩沖液是磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉組成，其中磷酸二氫鈉酸性較強。如果血液中的ph值過高的話，多余的堿就會與酸磷酸二氫鈉結合生成磷酸氫二鈉，反之，過酸時就會與磷酸氫二鈉反應產(chǎn)生磷酸二氫鈉，確保ph值就會穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)。維生素在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長.DMEMDMEM(A) 細胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號化合物名稱含量 (mg/L)序號化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣 .2H 2 O265.0018L-絲氨酸42.002硝酸鐵 .9H 2 O0.1019L-蘇氨酸95.003氯化鉀400.0020L-色氨酸16.004無水硫酸鎂97.6721L-酪氨酸72.005氯化鈉6400.0022L-纈氨酸94.006無水磷酸二氫鈉109.0023D-泛酸鈣4.007丁二酸75.0024酒石酸膽堿7.208丁二酸鈉100.0025葉酸4.009L-鹽酸精氨酸84.0026肌醇7.2010L-鹽酸胱氨酸63.0027煙酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黃素0.4012L-鹽酸組氨酸42.0029鹽酸硫胺4.0013L-異亮氨酸105.0030鹽酸吡哆辛4.0014L-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015L-鹽酸賴氨酸146.0032丙酮酸鈉110.0016L-甲硫氨酸30.0033酚紅9.30.0017L-苯丙氨酸66.00其它成分在一些較為復雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分.如在雜交瘤技術中常用的DMEM培養(yǎng)液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me 對細胞生長有很重要的作用.有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用.同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的損害.另一個重要作用是促進分裂原的反應和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛應用于雜交瘤技術，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細胞.2-Me是一種小分子還原劑，極易氧化.分子量為78.13，純的2-Me是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20），常用終濃度為510-5M.常配制成0.1M的儲存液，用時每升培養(yǎng)液加0.5ml.液體培養(yǎng)基保存液體培養(yǎng)基應于4冰箱避光保存，實驗前放入37預熱.未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12個月.液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解.如果細胞生長不良，可以再添加適量L-谷氨酰胺. 干粉培養(yǎng)基保存：4冰箱避光保存，有效期36個月.血清細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清，馬血清，人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清.胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴.新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大.如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種. 血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質(zhì).因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測,然后再，然后大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：需要長期保存的血清必須儲存于-20 - 70 低溫冰箱中.4冰箱中保存時間切勿超過1個月.由于血清結冰時體積會增加約10%，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂.一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌.如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清.瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 至 -70 低溫冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1天.然后移入室溫，待全部溶解后再分裝.在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生.切勿直接將血清從-20進入37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀.熱滅活是指56，30分鐘加熱已完全解凍的血清.加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活.除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質(zhì)量.補體參與反應有：細胞毒作用，平滑肌細胞收縮，肥大細胞和血小板釋放組胺，增強吞噬作用，促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學趨化和活化.切勿將血清在37放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會而影響血清質(zhì)量.血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量.可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理. 顯微鏡下小黑點:經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多.有些沉淀物在顯微鏡下觀察象小黑點,常誤認為血清受污染.一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清.四、細胞培養(yǎng)基本條件1，合適的細胞培養(yǎng)基合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng) 和促使細胞生長增殖的基礎物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境.2，優(yōu)質(zhì)血清目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清.血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分.3，無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件.在體外培養(yǎng) 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導致細胞中毒死亡.因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒，及時清除細胞代謝產(chǎn)物.4，恒定的細胞生長溫度維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度.5，合適的氣體環(huán)境氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳. 細胞培養(yǎng)基種類與基本成分 細胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基）,按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類.干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便.每種細胞都有其合適的培養(yǎng)基，五、清洗在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感.微生物產(chǎn)品附帶雜物,上次細胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細胞的生長.因此對新使用玻璃器皿和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法.玻璃器皿的清洗組織細胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗.一般玻璃器皿的清洗包括浸泡，刷洗，浸酸和沖洗四個步驟.清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì).浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉.新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質(zhì)等.新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì).再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上.刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì).刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度.浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀，濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸.清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì).清潔液去污能力很強.是清洗過程中關鍵的一環(huán).浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面.浸泡時間一般為過夜，不應少于6小時. 清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g) 濃硫酸（ml) 蒸餾水(ml) (A）強清潔液 63:1000:200000 (B）次強清洗液 120:200:1000 (C）弱清潔液 100:100:100. 清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分.配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸.并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā),配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸.并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應選擇塑料制品.配成后清潔液一般為棕紅色.沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗.使之盡量不留污染或潔液的殘跡.沖洗最好用洗滌裝置.即省力，效果又好.如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用.膠塞的清洗細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞.新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì).自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用.塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品.必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用.六、消毒細胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染.污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底.由于有關培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染. 消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線，濕熱，干烤，過濾等），化學滅菌法（各種化學消毒劑）和抗生素.紫外線消毒：用于空氣,操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿.紫外線直接照射方便，效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養(yǎng)室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用.紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射.溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛，效果最好的消毒方法.溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通.在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，