與PCR相關(guān)的計算機知識的應(yīng)用課件.doc

第一章 引物設(shè)計的原則首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應(yīng)（即錯配）。圍繞這幾條基本原則，設(shè)計引物需要考慮諸多因素，如引物長度（primer length）、產(chǎn)物長度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、G值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）、錯誤引發(fā)位點（false priming site）、引物及產(chǎn)物GC 含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等?？偨Y(jié)出以下的要點：1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即Taq 酶的最適溫度。2.引物3端的序列要比5端重要。引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。另外引物間3端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對PCR 影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。3.引物的GC含量一般為40-60%，以45-55為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5端增加Gs或Cs。但也有認為：原來普遍認為PCR引物應(yīng)當有50%的GC/AT比率的觀點其實是不對的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長250 bp，含有70% AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。4. 引物所對應(yīng)模板序列的Tm 值最好在72左右。（Tm 值曲線以選取72 度附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)），至少要在5580之間。5. G值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。3末端雙鏈的G是02 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6時只有40%、到8時少于20%、而10時接近于0。6. 可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高，錯誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為450 以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。7. Frq 曲線為Oligo6新引進的一個指標，揭示了序列片斷存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用Frq 值相對較低的片斷。8. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進行，與二聚體相關(guān)的一個參數(shù)是堿基的分布，3端的連續(xù)GGG 或CCC 會導(dǎo)致錯誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其G為3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結(jié)果，但是如果它的3末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5末端對反應(yīng)就沒有多大的影響了。9. 以公式(4G/C + 2A/T5)計算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度。4-6的差別似乎對PCR產(chǎn)量影響不大。最好，保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75范圍內(nèi)。10. 要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設(shè)計很長，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618 mer)的引物：若產(chǎn)物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的產(chǎn)物。11. 在DNA測序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無論如何，寡核苷酸3末端最后5個核苷酸的穩(wěn)定性小于9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。12. 如果用3末端低穩(wěn)定性的引物，反應(yīng)的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應(yīng)。13. 引物的唯一性：為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列。如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應(yīng)當避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重復(fù)(如ATATAT)。14. 引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。15. 對引物的修飾一般是增加酶切位點，應(yīng)參考載體的限制酶識別序列確定，常常對上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識別序列，以有利于以后的工作。16. 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件較差，比如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；有時PCR產(chǎn)物要作為克隆對象插入到載體中表達，因此PCR引物設(shè)計的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時，使用自動搜索引物及正確地評價引物可使研究人員對實驗心中有數(shù)。17. 在設(shè)計克隆PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切點，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達到最好效果，對引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。18. 如擴增出多條帶（引發(fā)錯配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下）。第二章Primer Premier 5.0Primer Premier是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設(shè)計，評估的軟件。其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（Motif）。這里我們主要介紹其引物設(shè)計功能，其他功能的介紹請參看Plasmid Premier2.02。打開程序首先進入的是序列編輯參看，有一個語音校正的功能，即在輸入序列的時候，程序自動將堿基讀出，以便用戶進行校正，保證輸入的正確和快速。點擊該界面的按鈕即可進入到程序的引物設(shè)計窗口。該界面共分為四層，最上面一層左面是5個控制按鈕，用于實現(xiàn)引物設(shè)計中的各種功能，包括引物自動尋找，尋找結(jié)果查看和引物編輯；右邊是觀察兩個引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖以及對正鏈還是負鏈引物進行選擇；第二層是顯示模板和引物序列及二者間的配對情況的顯示；第三層是顯示兩個引物的各種參數(shù)，包括給引物的打分，引物以及產(chǎn)物的起始位置、長度、Tm值、GC消光系數(shù)、簡并性；最后一層是給出的有關(guān)于引物的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、錯配情況和引物間二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測，左邊是顯示是否存在以上各種對PCR擴增有影響的結(jié)構(gòu)，右邊顯示的是這些結(jié)構(gòu)的位置，結(jié)構(gòu)細節(jié)和穩(wěn)定能，利用這些參數(shù)可以對引物作出可靠的評價。下面是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類型，包括PCR引物，測序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終PCR產(chǎn)物的長度和引物的長度等。并通過來點擊按鈕來設(shè)置一些搜尋參數(shù)：這些參數(shù)包括引物的Tm值，GC比，有簡并性堿基，3端穩(wěn)定性，引物的穩(wěn)定性，重復(fù)序列，二聚體/發(fā)卡結(jié)構(gòu)和與模板及可能的雜質(zhì)DNA（需要從另外的序列文件中讀入）之間的錯配情況，這些參數(shù)的設(shè)定可以根據(jù)要求變化，程序本身根據(jù)一定的標準分成從極高嚴謹性到極低嚴謹性5個檔次。該程序?qū)σ锏淖詣铀阉鬟^程是采用的排除法，根據(jù)用戶設(shè)定的引物范圍和產(chǎn)物長度所規(guī)定區(qū)域內(nèi)，所有的符合設(shè)定的引物長度的寡核苷酸都被視為可能的引物，然后根據(jù)以上各個參數(shù)逐步去除不符合條件的寡核苷酸，經(jīng)過這種層層剔除的篩選，最終找到符合用戶所設(shè)定標準的引物，如果找不到合適的引物可以逐步降低要求來進行進一步搜尋。搜尋到引物結(jié)果最終顯示在下面的窗口中：在結(jié)果窗口中給出了程序給該對引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長度以及產(chǎn)物的長度。通過直接點擊各對引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。其中用File菜單中的Parameter命令可以對系統(tǒng)參數(shù)，PCR反應(yīng)條件和程序打分系統(tǒng)進行設(shè)置，以幫助用戶根據(jù)自己的特殊要求來進行引物設(shè)計，其中反應(yīng)條件按照引物濃度，單價離子濃度，Mg離子濃度，Na鹽濃度等。而打分系統(tǒng)是參照的以下公式：利用該打分系統(tǒng)可以為對引物進行有效評估和和在引物之間進行對比選擇提供有效的依據(jù)。最后還可以在利用引物編輯窗口對程序自動找到的或手工找到的引物序列進行編輯，以便用戶能在引物引入突變及加入特定的酶切位點，并對修改后的序列的二聚體結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和錯配進一步評估。其中是對修改后的引物再次搜尋找出其最合適的引發(fā)位置。除了以上的直觀地對引物進行基本的設(shè)計和評估功能外，該程序還提供了多種數(shù)據(jù)報告，主要通過Report菜單和Graph菜單中命令來實現(xiàn)：另外，Primer Premier在引物設(shè)計上一個比較獨到的功能，就是能輔助進行巢式PCR引物設(shè)計，在首先進行了引物自動搜索后，即可通過Function菜單中Multiplex/Nested Primer命令進入巢式PCR引物設(shè)計，通過點中代表各個引物的三角號來選擇引物，然后根據(jù)最下面的窗口中各個引物之間的二聚體形成情況來判斷引物是否適合于作為巢式PCR的引物。另外該菜單中的Database命令可以讓用戶建立自己的引物數(shù)據(jù)庫，方便于查找和對照。整體而言，Primer Premier這個軟件在引物設(shè)計方面還是比較優(yōu)秀的，能夠?qū)θ娴慕o出一個引物的各種參數(shù)，并在多個必需的方面對引物作出有效的評價，但是在程序設(shè)計中還有一些不足，例如在錯配情況中，只對是否存在錯配作出了預(yù)測，也給處理錯配的穩(wěn)定性，但是錯配對PCR的影響還需要根據(jù)錯配是否發(fā)生在引物的3來判斷，3發(fā)生的錯配要比其他位置的錯配對引物的引發(fā)效率的影響大的多，所以在使用中應(yīng)當結(jié)合著錯配的具體配對情況來綜合分析，這方面程序未能進行量化，只有通過用戶根據(jù)經(jīng)驗判斷；另外，程序?qū)τ诋a(chǎn)物的Tm值和引物Tm值之間的差異也為能給出評價，如果二者差異較大（如22），則容易造成退火時引物模板和模板模板退火之間的競爭。而在結(jié)果輸出方面，該程序也只能以圖文格式打印，無法轉(zhuǎn)換成文本格式。第三章Oligo 6.0在專門的引物設(shè)計軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.0的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個圖，加了個Frq圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風(fēng)靡全世界。oligo的下載和安裝我就不多說了，打開oligo相信也無需多講。打開oligo的頁面如下： 單擊file菜單再點open或點擊“打開”快捷圖標或者用快捷鍵“CTrlO”可打開下面的窗口，在打開的OPEN窗口內(nèi)選擇FreqSeq再點“打開” 選擇drosfr或者其它一個文件點擊“打開”，出現(xiàn)以下窗口，點擊“window”， 再點擊“Tile”，出現(xiàn)以下窗口： 圖中顯示的三個指標分別為Tm、G和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，委鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。G值反映了序列與模板的結(jié)合強度，最好引物的G值在5端和中間值比較高，而在3端相對低（如圖：） Tm值曲線以選取72附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo 6”新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用3端Frq值相對較低的片段再點擊Search再點“For Primers and probes”或使用快捷鍵F3 ， 出現(xiàn)以下窗口，點OK就OK了。當然你也可以點擊“Prameters”和“Search Range”選擇你要的參數(shù)和你上下游引物的位置及你擴增產(chǎn)物的長度。 出現(xiàn)Search Status窗口，點“OK”， 出現(xiàn)Primer pairs窗口，代表引物對的編號，依次為引物對