研究生基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).doc

廣東省高教廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)教材基因工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(研究生教材)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基因工程實(shí)驗(yàn)分室二零零五年二月編 者 的 話 本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)是為廣東省高教廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之一的“現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室”開設(shè)的“基因工程原理和方法”而編寫的。本課程主要面向廣州石牌地區(qū)六所高校的研究生，也包括部分高年級(jí)本科生。該課程以實(shí)驗(yàn)為主，為保證學(xué)生在修讀本課程時(shí)有較好的理論基礎(chǔ)，要求所有修課學(xué)生預(yù)修“分子生物學(xué)”或“分子遺傳學(xué)”。 本課程實(shí)驗(yàn)采用了一個(gè)內(nèi)容連貫的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(用質(zhì)粒載體克隆植物DNA片段)，作為同學(xué)們掌握DNA體外重組基本技術(shù)的訓(xùn)練(實(shí)驗(yàn)一至實(shí)驗(yàn)七)。另外，根據(jù)本研究室多年教學(xué)、研究工作的經(jīng)驗(yàn)，我們還把反映近年基因工程技術(shù)發(fā)展的PCR、Southern雜交技術(shù)等納入實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，以保證學(xué)生修完本課程后能較快地開展相應(yīng)研究工作，更好地適應(yīng)未來(lái)研究工作的需要。 本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)由莊楚雄、穆虹、易繼財(cái)、姚涓、吳豪、張群宇、劉耀光、梅曼彤等老師參加編寫，易繼財(cái)老師負(fù)責(zé)指導(dǎo)書的編輯等工作。 本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)為試用第三版，試用后我們將根據(jù)各校修課的情況和要求作進(jìn)一步修改，敬請(qǐng)兄弟院校的同行多提寶貴意見。 編 者 2005年2月目 錄基因工程實(shí)驗(yàn)室學(xué)生守則 3實(shí)驗(yàn)一 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA 4實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳 7實(shí)驗(yàn)三 DNA的酶切 9實(shí)驗(yàn)四 目的片段的回收 11實(shí)驗(yàn)五 DNA的體外連接 12實(shí)驗(yàn)六 重組DNA的轉(zhuǎn)化 15實(shí)驗(yàn)七 重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定 18實(shí)驗(yàn)八 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR ) 19實(shí)驗(yàn)九 植物DNA的抽提 21實(shí)驗(yàn)十 基因組DNA的Southern雜交分析 24附錄I. 各種試劑的母液配方 28附錄II. 常用實(shí)驗(yàn)器具的清洗方法 31主要參考書 32基因工程實(shí)驗(yàn)室學(xué)生守則 1. 實(shí)驗(yàn)課前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，了解實(shí)驗(yàn)原理和基本操作過(guò)程。 2. 實(shí)驗(yàn)課不得無(wú)故缺席、遲到或早退。非課表規(guī)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，應(yīng)按任課老師的安排，準(zhǔn)時(shí)來(lái)進(jìn)行操作。 3. 實(shí)驗(yàn)課時(shí)，應(yīng)自覺遵守課堂紀(jì)律，保持實(shí)驗(yàn)室的安靜與清潔衛(wèi)生，不得大聲談笑，不得抽煙、隨地亂丟紙屑、吐痰等。 4. 實(shí)驗(yàn)前清點(diǎn)好儀器、用具與試劑，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)隨時(shí)保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用畢，應(yīng)立即蓋嚴(yán)放回原處。勿使試劑、藥品灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地面上。 5. 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)心觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)完成后，要寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 6. 實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)清洗好當(dāng)天所用的器皿和用具，整理好儀器與實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，經(jīng)任課教師同意方可離開。 7. 使用儀器、藥品、試劑和各種其它物品需注意節(jié)約。洗滌和使用儀器時(shí)，應(yīng)小心仔細(xì)，防止損壞儀器。 8. 廢液可倒入水槽內(nèi)，同時(shí)放水沖走，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等腐蝕性液體，應(yīng)先用水稀釋后，方可倒入水槽內(nèi)，并放水沖走。廢紙等其它固體廢物，不得倒入水槽，應(yīng)倒入廢物桶內(nèi)。 9. 嚴(yán)禁隨意動(dòng)用非當(dāng)天實(shí)驗(yàn)所需使用的儀器和物品，使用儀器應(yīng)嚴(yán)格按儀器使用的程序進(jìn)行，貴重儀器需在任課老師的指導(dǎo)下進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如儀器出現(xiàn)故障，應(yīng)及時(shí)向任課老師匯報(bào)情況，如違反使用規(guī)定造成的損壞，使用者將負(fù)責(zé)修理與賠償。 10. 每次實(shí)驗(yàn)課由任課教師安排學(xué)生輪流值日，值日生負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生、安全和一切服務(wù)性的工作，最后關(guān)好水電、門窗，經(jīng)任課教師檢查同意后方可離開。實(shí)驗(yàn)一 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA一、目的 學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。二、原理 質(zhì)粒DNA的提取常用堿裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以堿裂解法最為常用。本方法有質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、快速等優(yōu)點(diǎn)。其原理為: 在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在高堿性pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)充分分離，當(dāng)加入中和緩沖液調(diào)時(shí)，變性質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型；而線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復(fù)合物。通過(guò)離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中?；祀s的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋白質(zhì)。三、實(shí)驗(yàn)材料 含質(zhì)粒pBluescript II的大腸桿菌DH10B。四、儀器設(shè)備 高壓滅菌鍋 超凈工作臺(tái) 恒溫?fù)u床 臺(tái)式離心機(jī)（冷凍式或非冷凍式） 旋渦振蕩器五、實(shí)驗(yàn)用具 培養(yǎng)用試管 量筒 冰盒 微量離心管 微量取液器 吸管頭若干六、試劑(配制方法見附錄) LB培養(yǎng)基 氨芐青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS 溶液I； 溶液II(最好現(xiàn)配現(xiàn)用)； 溶液III(-20預(yù)冷) 4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2) 無(wú)水乙醇 TE緩沖液(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇 飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，注：在本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的其它章節(jié)省略為“酚/氯仿”，而“氯仿”均指已加入了1/24體積的異戊醇)七、實(shí)驗(yàn)步驟1. 細(xì)菌的培養(yǎng)(1) 配制LB液體和瓊脂培養(yǎng)基，并高壓滅菌。(2) 在含Amp 100 mg/ml的瓊脂培養(yǎng)基平板上(劃線或涂抹)培養(yǎng)出單菌落(37，1820小時(shí))。(3) 在培養(yǎng)管中加入含Amp 100 mg/ml的LB液體培養(yǎng)基(45 ml/管)，挑取單菌落至培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)管傾斜插在搖床中，37搖過(guò)夜(約200 rpm，1416小時(shí)，一般不超過(guò)18小時(shí))。如需大量提取，挑取單菌落至接入含50 ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37搖18小時(shí)。2. 質(zhì)粒DNA的抽提（如使用冷凍離心機(jī)，設(shè)為4預(yù)冷）吸取1.5 ml菌液至1.5 ml離心管中。 離心(5000 rpm, 2分鐘)，棄上清液。如想提取多一點(diǎn)DNA，再吸取1.5 ml菌液至同一離心管中，離心，棄上清液。用移液器盡可能除去上清液。加入150 ml溶液I ，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。加入250 ml溶液II ，緩慢地上下翻轉(zhuǎn)離心管10多下，溫和混勻。室溫下放置5分鐘。加入180 ml預(yù)冷的溶液III ，上下翻轉(zhuǎn)離心管10多下，溫和混勻，冰浴10分鐘，或放入20冰箱5分鐘（避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生凍結(jié)）。離心 (12000 rpm，5分鐘，4)。（離心完后把離心機(jī)溫度設(shè)為20）。移取上清液。加2/3倍體積的酚/氯仿抽提，離心 (12000 rpm，5分鐘)。 移取上清液（約500550ml），加2倍體積無(wú)水乙醇（大量提取時(shí)上清液的容量大，可用0.6倍體積異丙醇代替乙醇），混勻。離心（12000 rpm，5分鐘，室溫)，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精，風(fēng)干10分鐘。加50100 ml TE(含20 mg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37放置數(shù)小時(shí)，-20保存?zhèn)溆?。高拷貝質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量一般為35 mg/ml菌液。此DNA可直接用于限制性內(nèi)切酶切割等反應(yīng)。如需要更高純度的DNA，可進(jìn)一步純化。3. 質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化加入TE使DNA溶液為100 ml，加入100 ml酚/氯仿，充分振蕩。離心(12000 rpm, 5分鐘)，吸取上清液。加入1/10體積的3 M NaAc，加2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻。置于-70oC冰箱約10分鐘以上或-20oC冰箱30分鐘至數(shù)小時(shí)。離心（12000 rpm，15分鐘，4oC)，倒掉酒精，離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精，風(fēng)干。加50100 ml TE溶解DNA沉淀。(如大量提取質(zhì)粒DNA，溶液I，II，III的用量可相應(yīng)增加，如培養(yǎng)液為50 ml時(shí)，溶液I，II，III的用量可分別為2 ml，4.0 ml，3 ml）。 本實(shí)驗(yàn)方法提取及純化的質(zhì)粒DNA的純度只能滿足一般目的的要求。對(duì)于純度要求很高的情況，如作為克隆載體和測(cè)序的模板，最好使用廠商提供的質(zhì)粒純化試劑盒提取。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 高壓消毒需專人看管，壓力至0.5磅時(shí)拔下電源插頭放氣，繼續(xù)加熱至1.0磅保持20分鐘(通、斷開關(guān)控制)。2. 無(wú)菌操作臺(tái)使用前，開紫外燈滅菌，開紫外燈時(shí)勿開鼓風(fēng)裝置。3. 對(duì)抗菌素不能用高溫滅菌，需待培養(yǎng)基滅菌后冷卻到不燙手的時(shí)候再加入。4. 為避免細(xì)菌污染環(huán)境，多余的菌液經(jīng)煮沸殺滅后方可倒入洗滌槽。5. 加入溶液II、溶液III搖勻時(shí)一定要溫和，不能劇烈搖動(dòng)。6. 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液時(shí)，應(yīng)注意勿將下層酚/氯仿吸入以免帶入雜質(zhì)；但也不要留下太多上清液，使DNA損失較多。九、實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排1. 第一天下午配制液體和瓊脂培養(yǎng)基。（5:30）左右在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接菌，培養(yǎng)過(guò)夜長(zhǎng)出單菌落。2. 第二天下午（5:30）挑取單菌落植菌培養(yǎng)過(guò)夜。3. 上午9:00左右停止培養(yǎng)，于室溫或4存放。下午抽提質(zhì)粒（純化在實(shí)驗(yàn)二電泳期間進(jìn)行）。實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳一、目的 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法，檢測(cè)質(zhì)粒DNA的純度、濃度與分子量。二、原理 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠(EB)為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測(cè)到5 ng以上的DNA。 質(zhì)粒DNA有環(huán)狀超螺旋、開環(huán)、和線性三種構(gòu)型，電泳時(shí)其遷移率各不同(超螺旋 線性 開環(huán))。三、實(shí)驗(yàn)材料 上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒DNA。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 微波爐 電泳儀 微型電泳槽 紫外透射檢測(cè)儀 五、實(shí)驗(yàn)用具 微量取液器 吸管頭若干 加樣板 量筒100 ml1 三角瓶500 ml1 透明膠帶六、試劑(配制方法見附錄) 瓊脂糖 10TBE電泳緩沖液 10載樣緩沖液 EB母液（0.5 mg/ml）DNA(Hind)七、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 制膠 (1) 稱取0.8 g瓊脂糖加入盛有100 ml 1TBE電泳緩沖液的500 ml三角瓶中，搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。在微波爐或電爐上加熱至瓊脂糖完全熔解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約60后，加入100 ml的0.5 mg/ml溴化乙錠（EB，終濃度為0.5 mg/ml）或者5 ml的Gold View溶液，并搖勻。 (2) 用膠帶將制膠板兩端封好，將溶解的瓊脂糖(約50)倒入其中，直至厚度為46 mm。 (3) 插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，在室溫下冷卻凝固。 (4) 充分凝固后撕掉兩端的膠布，小心垂直向上拔出梳子，以保證點(diǎn)樣孔完好。 (5) 將凝膠置入電泳槽中，加電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠12 mm。 2. 點(diǎn)樣 用微量取液器(P20) 吸取實(shí)驗(yàn)一的DNA樣品2 ml于點(diǎn)樣板小孔中，再加入8 ml TE或電泳緩沖液及1 ml的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。同時(shí)點(diǎn)10mlDNA(Hind酶切,30 ng/ml)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。 4. 電泳 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至35 V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約一小時(shí)后即可觀察。 5. 觀察 將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，戴上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過(guò)線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。八、注意事項(xiàng) 1. 用微波爐煮膠時(shí)，膠液的量不應(yīng)超過(guò)三角瓶容量的1/3，否則易溢出。 2. 煮好的膠應(yīng)冷卻至50左右時(shí)再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機(jī)會(huì)。 3. 倒膠注意厚度(46 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10多分鐘，以加速膠的凝固。 4. 加樣前趕走點(diǎn)樣孔中的氣泡，點(diǎn)樣時(shí)吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。 5. 一般情況下不必每點(diǎn)一個(gè)樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液洗幾次即可再點(diǎn)下一個(gè)樣品。 6. 凝膠中含有EB，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。九、時(shí)間安排一個(gè)下午完成。在電泳進(jìn)行期間，按實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化。實(shí)驗(yàn)三 DNA的濃度測(cè)定及酶切一、目的 學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液濃度及利用限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法，并通過(guò)電泳檢測(cè)酶切的效果，為以后的連接作準(zhǔn)備。二、原理 DNA的吸收光譜峰在260 nm處，據(jù)計(jì)算，測(cè)定此波長(zhǎng)下DNA溶液的OD值， 當(dāng)OD260= 1時(shí)，雙鏈DNA含量約為50 mg/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280 nm處，在測(cè)定DNA含量時(shí)，還常計(jì)算OD260/OD280之值，如該值為1.82.0時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。 目前已發(fā)現(xiàn)三類不同的限制性內(nèi)切酶即I型、II型和III型。其中II型能專一識(shí)別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶HindIII識(shí)別的堿基序列為：酶切作用后產(chǎn)生5突出的粘性末端 5-AAGCTT-3 A 5-AGCTT 3-TTCGAA-5 TTCGA-5 A 酶切反應(yīng)需Mg2+及其它一些輔助離子和一定的鹽離子濃度，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過(guò)高(5%)，會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性(star activity)。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37，也有個(gè)別要求在50 65。三、實(shí)驗(yàn)材料 提純的質(zhì)粒DNA和水稻基因組DNA。四、儀器設(shè)備 分光光度檢測(cè)儀 電泳儀 微型電泳槽 紫外透射檢測(cè)儀 恒溫培養(yǎng)箱 五、實(shí)驗(yàn)用具 微量取液器 微量離心管(0.5 ml1) 吸管頭若干 點(diǎn)樣板六、試劑 限制性內(nèi)切酶HindIII及對(duì)應(yīng)的緩沖液(試劑商提供) 無(wú)菌雙蒸水 10TBE電泳緩沖液 0.8%瓊脂糖 載樣緩沖液七、實(shí)驗(yàn)步驟 1. DNA濃度純度的測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)一的DNA 2 ml (約100 200 ng)至一干凈的離心管，加入198 ml蒸餾水稀釋。先加200 ml 蒸餾水至比色杯，進(jìn)行紫外光空白測(cè)定，然后倒掉蒸餾水，加入200 ml已稀釋的DNA溶液，測(cè)定260 nm及280 nm的光吸收值(OD260及OD280)，計(jì)算DNA濃度及OD260/OD280比值。 2. 酶切：按下表配制酶解混合液DNA緩沖液(1/10 V) 10 mlDNA45 mg加雙蒸水至總體積(V)100 ml酶(HindIII)40 U 混勻，37保溫1.5 3小時(shí)，電泳前在4保存。 3. 電泳檢測(cè)：取酶解液310 ml電泳 (具體步驟見實(shí)驗(yàn)二)。 4. 觀察結(jié)果。八、注意事項(xiàng) 1. 用紫外分光光度法測(cè)DNA含量時(shí)，對(duì)純度不高的DNA測(cè)定結(jié)果往往不準(zhǔn)確(偏高)，且測(cè)定所用DNA量較多。用瓊脂糖凝膠法電泳(與已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照)定量更為可靠。 2. 酶切的DNA應(yīng)具備一定的純度，其中不能含跡量的酚、氯仿、SDS等。 3. 反應(yīng)總體積中甘油的濃度要小于5，即內(nèi)切酶的體積應(yīng)小于10%反應(yīng)總體積(購(gòu)來(lái)的酶含50甘油)。 4. 內(nèi)切酶從-20冰箱取出后，應(yīng)放入冰浴中，在其它試劑加完后最后加。 5. 每次取酶必須使用新的滅菌吸管頭，1個(gè)吸管頭不能反復(fù)使用，更不能交叉使用。 6. 注意混勻，可用用手指輕彈管壁，使酶切體系所有成分混勻，然后短暫離心，使管壁液滴沉入管底。九、時(shí)間安排DNA濃度純度測(cè)定、酶切，一個(gè)下午；電泳檢測(cè)一個(gè)下午。實(shí)驗(yàn)四 目的片段的回收一、目的 DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化以后，產(chǎn)生較小的片段，我們須從中選出我們需要的片段（目的片段），進(jìn)一步作亞克隆，或用作探針。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們將學(xué)習(xí)掌握從瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的一種方法。二、原理 回收目的片段的方法有多種，常用的有凍融法、低熔點(diǎn)瓊脂糖法、透析袋法、電泳回收法、玻璃孔回收法等。本實(shí)驗(yàn)采用電泳回收法。通過(guò)特別的V形電泳槽，將挖出的含有目的片段的凝膠置于V形槽前，接通電泳電源，DNA即進(jìn)入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管較小，回收的DNA片段能保持較高的濃度。三、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)三酶切的水稻基因組DNA。四、儀器設(shè)備 電泳儀 電泳槽 V形管回收電泳槽 紫外透射檢測(cè)儀 五、實(shí)驗(yàn)用具 微量取液器 吸管頭若干 刀片 微量離心管 扁頭鑷子六、試劑 0.8%瓊脂糖 10TBE電泳緩沖液 7 M醋酸銨 載樣緩沖液七、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 大量酶切產(chǎn)物的電泳分離。 瓊脂糖為0.8，選用大型電泳槽及厚梳子，并在低電壓下電泳以提高分辨率。 2. 紫外燈下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝膠。 3. 把凝膠片置于特制的“V”型槽平臺(tái)上，在“V”型槽中加入0.5TBE電泳緩沖液(使其剛好淹過(guò)膠面)，再在“V”型孔中加入7 M NH4Ac，接通電源進(jìn)行電泳。 4. 紫外燈下檢測(cè)凝膠塊是否含有DNA，判斷DNA是否全部進(jìn)入V形管溶液中。 5. 當(dāng)DNA進(jìn)入V形管中，放掉電泳槽中的緩沖液，吸出V形管中的溶液。 6. 溶液加兩倍體積的無(wú)水酒精，混勻，置-70oC兩小時(shí)或-20oC過(guò)夜。 7. 12000 rpm離心10分鐘，沉淀用70酒精洗一次，風(fēng)干，加入10 ml TE。取1 ml與8 ml TE及1ml載樣緩沖液混合，電泳檢查并根據(jù)帶的亮度估算其濃度。八、注意事項(xiàng) 挖含目的DNA的凝膠時(shí)，盡量減少周圍凝膠的帶入。九、時(shí)間安排 一個(gè)下午。實(shí)驗(yàn)五 DNA的體外連接一、目的 學(xué)習(xí)DNA重組技術(shù)中的核心步驟，DNA片段之間的體外連接方法，將實(shí)驗(yàn)四回收的目的片段與載體質(zhì)粒片段進(jìn)行定向連接。二、原理 DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段5端磷酸和3端羥基之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶主要有：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌連接酶兩種。T4 DNA連接酶的底物可為：(1) 一條鏈帶有缺口的雙鏈DNA分子；(2) 兩個(gè)存在互補(bǔ)粘性末端的雙鏈DNA片段；(3) 兩個(gè)存在平末端的DNA片段；(4) RNADNA雜合體中，具缺口的RNA和DNA分子。大腸桿菌DNA連接酶適當(dāng)?shù)牡孜镏皇菐笨诘碾p鏈DNA分子和具有同源互補(bǔ)粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之間的連接。 T4 DNA連接酶催化DNA連接的反應(yīng)分三步進(jìn)行：(1) 輔助因子ATP中磷酸基團(tuán)與T4 DNA連接酶上的Leu殘基的NH2結(jié)合，形成酶-AMP復(fù)合物；(2) 酶-AMP復(fù)合物活化DNA鏈5端的磷酸基團(tuán)，形成磷酸磷酸酯鍵；(3) DNA鏈3端的羥基活化與5端磷酸根形成磷酸二酯鍵，釋放AMP，完成DNA鏈間的連接。大腸桿菌DNA連接酶催化DNA分子連接的機(jī)制及反應(yīng)過(guò)程大致與T4 DNA連接酶相同，只是輔助因子為NAD+。用于克隆的質(zhì)粒載體在酶切成線狀后，一般需用堿性磷酸酯酶(CIP或BAP)進(jìn)行去磷酸化處理，以防止載體自身環(huán)化，減少不含重組子的菌落產(chǎn)生。三、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)四所得的DNA片段，以及用質(zhì)粒純化試劑盒提取的高純度載體質(zhì)粒pBluescript II(由教師提取)。四、儀器設(shè)備 恒溫水浴鍋 低溫恒溫水浴鍋 電泳儀 電泳槽 紫外透射檢測(cè)儀 五、實(shí)驗(yàn)用具 微量取液器 吸管頭若干 微量離心管(1.5 ml，已滅菌)六、試劑 HindIII及10反應(yīng)緩沖液 無(wú)菌雙蒸水 堿性磷酸酯酶(CIP) 1 M Tris-HCl (pH9.0) T4 DNA連接酶及10緩沖液(含ATP) 酚:氯仿七、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 載體的酶切和去磷酸化處理(1) 在離心管中加入5 mg pKS質(zhì)粒 DNA，10 ml 10 HindIII緩沖液，加雙蒸水至98 ml，最后加入20 U HindIII酶。充分混勻，離心30秒，在37恒溫水浴鍋保溫30分鐘。(2) 加入5 ml 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混勻，離心30秒，在37恒溫水浴鍋保溫，60分鐘。(加pH9.0的Tris-HCl緩沖液，目的是將pH7.5 8.0的酶切緩沖液的pH值調(diào)到適合CIP的pH8.5左右)。(3) 溫育結(jié)束時(shí)，加EDTA (pH 8.0)至終濃度為5 mM，混勻，于65加熱60分鐘(或于7510分鐘)。然后用酚/氯仿抽提兩次；上清液加0.1體積3 M醋酸鈉，充分混勻，再加2.5倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻后于-20放置15分鐘。12000 rpm離心15分鐘，沉淀用冷70酒精洗一次，風(fēng)干后用40 ml TE溶解(DNA濃度約為80100 ng/ml)。 2. 連接 在微量離心管中加入 載體DNA 1 ml (80100ng) 目的片段DNA 50-100 ng ddH2O 加至8ml混勻，45 50，5分鐘(使粘性末端分開）加入10T4 DNA連接酶緩沖液1 ml用1連接酶緩沖液將連接酶稀釋成0.2 Weiss單位或12 NEB單位/ml再加入已稀釋的T4 DNA連接酶1 ml混勻，稍離心，在PCR儀上進(jìn)行連接反應(yīng)65，5min，置于4oC保存?zhèn)溆冒恕⒆⒁馐马?xiàng)1. 克隆用的載體質(zhì)粒要求較高純度，使之能用最少的酶和較短的反應(yīng)時(shí)間達(dá)到完全的切斷。使用過(guò)量的內(nèi)切酶或CIP以及過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)會(huì)使載體末端缺失，產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性菌落(白色但沒有插入子)。2. 使用T4 DNA連接酶之前，應(yīng)看清楚生產(chǎn)廠家所使用的活性定義單位，以便采用合適的酶濃度反應(yīng)條件，不致造成不必要的浪費(fèi)。3. 目的DNA片段與載體DNA之間的摩爾濃度比例一般是3:11:1，并且使反應(yīng)體系中DNA的總末端濃度適于DNA分子之間連接，但又不易形成多分子連接的寡聚物，造成片段多拷貝插入。九、時(shí)間安排 二個(gè)下午。實(shí)驗(yàn)六 重組DNA的轉(zhuǎn)化一、目的 學(xué)習(xí)將體外重組DNA(實(shí)驗(yàn)五的連接產(chǎn)物)引入受體細(xì)胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中篩選出轉(zhuǎn)化子的常用方法。二、原理 把外源DNA分子導(dǎo)入到某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。當(dāng)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)即感受態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)化最易發(fā)生。常用的轉(zhuǎn)化方法是用CaCl2處理受體菌，使細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入敏感的感受態(tài)。當(dāng)細(xì)菌處于冰凍(0)的CaCl2溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA。在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，載體中抗抗生素基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。 本實(shí)驗(yàn)所用重組DNA的載體帶有E.coli中的b-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的調(diào)控序列和部分編碼序列，編碼區(qū)內(nèi)插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，進(jìn)入宿主菌后可與宿主細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)a-互補(bǔ)而產(chǎn)生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成蘭色菌落。如有外源DNA插入到質(zhì)粒的該位點(diǎn)，則破壞了互補(bǔ)能力，菌落呈白色。三、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)五的連接產(chǎn)物(重組DNA)、受體菌(E.coli，DH5a)。四、儀器設(shè)備 高壓滅菌鍋 超凈工作臺(tái) 冷凍高速離心機(jī) 恒溫水浴鍋 冰箱 恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱五、實(shí)驗(yàn)用具 離心管50 ml1 電爐 試管1 微量取液器 微量離心管 培養(yǎng)皿 冰浴保溫瓶 錐形瓶150 ml1 燒杯六、試劑 LB培養(yǎng)基 無(wú)菌雙蒸水 氨芐青霉素(Amp) 0.1 mol/L CaCl2 SOC培養(yǎng)基 X-gal IPTG七、實(shí)驗(yàn)步驟 1 . 感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取E.coli DH5a受體菌單菌落(23 mm)于有50 ml LB培養(yǎng)基的500-ml錐形瓶中。37振蕩(250rpm)培養(yǎng)約2.5小時(shí)(活細(xì)胞數(shù)不超過(guò)108個(gè)/ml)。（以下步驟均在超凈工作臺(tái)操作）超凈工作臺(tái)上，倒入經(jīng)消毒的50 ml離心管中，蓋嚴(yán)。在1L燒杯冰浴中放置10分鐘，使菌液冷卻至0。4，4000 rpm離心10分鐘收集菌體。棄上清液，倒置在紙巾上1分鐘。加10 ml預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2 ，懸浮菌體。冰浴25分鐘。離心（4，4000 rpm，10分鐘）。加入1.5 ml 預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2，小心懸浮4冰箱保存過(guò)夜(1224小時(shí))。 2 . 轉(zhuǎn)化 在1.5 ml離心管中加入感受態(tài)細(xì)胞ddH2O連接物載體質(zhì)粒重組質(zhì)?？瞻讓?duì)照200 ml2 ml000CK(陰性對(duì)照)200 ml001ml (10 ng)0CK(陽(yáng)性對(duì)照)200 ml001 ml(10 ng)自我環(huán)化對(duì)照200 ml02 ml(不含插入子)00處 理200 ml02 ml00用吸管頭溫和混勻冰浴30分鐘42，靜置90秒冰浴23分鐘加入800 ml 37預(yù)熱的SOC液體培養(yǎng)基用1000-ml取液器移至培養(yǎng)管，37搖動(dòng)（200rpm）45分鐘。各取100200 ml涂板，將培養(yǎng)皿置于室溫至液體被吸收。倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)過(guò)夜.觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果(白色為陽(yáng)性，藍(lán)色為陰性)八、注意事項(xiàng)1. 為了達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化效率，LB和SOC液體培養(yǎng)基需用進(jìn)口的胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出粉（Yeast extract）。2. 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用的玻璃器皿、微量吸管、離心管管，應(yīng)徹底洗凈并進(jìn)行高壓消毒，表面去污劑、化學(xué)試劑的污染將大大降低轉(zhuǎn)化率。微量吸管應(yīng)剪去尖端擴(kuò)大口徑。3. 制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間最好以O(shè)D值來(lái)決定。對(duì)某種菌株在培養(yǎng)后不同時(shí)間取樣測(cè)定OD600值，比較不同OD值時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，以確定對(duì)該種菌株的最佳OD值，以后每次實(shí)驗(yàn)就以確定的OD值為指標(biāo)選用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。4. 轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞應(yīng)盡量保持低溫，離心管應(yīng)提前預(yù)冷。5. 受體菌細(xì)胞經(jīng)CaCl2處理后，細(xì)胞壁較脆，懸浮時(shí)小心操作。6. 制備好的感受態(tài)細(xì)胞可急凍保存?zhèn)溆茫涸?L燒杯中裝入100ml無(wú)水酒精，在-70 -80冰箱預(yù)冷。將感受態(tài)細(xì)胞分裝入離心管(0.2 ml/管)，置于-80酒精急凍，并保存在-70 -80冰箱。九、時(shí)間安排 實(shí)驗(yàn)前一天下午下班前接種劃平板。 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午下班(11:30)前搖菌。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天下午約2:00開始制備感受態(tài)細(xì)胞，配培養(yǎng)基、滅菌、倒平板，第二天下午做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)七 重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定一、目的 掌握快速鑒定重組轉(zhuǎn)化子的方法。二、原理 雖然大部分質(zhì)粒載體都可通過(guò)藍(lán)白色選擇重組轉(zhuǎn)化子，但在實(shí)際應(yīng)用中往往有相當(dāng)部分的白色克隆是不含插入子的。本鑒定方法是用堿性裂解液把轉(zhuǎn)化子菌體裂解，然后直接用瓊脂糖凝膠分離，通過(guò)比較白色和蘭色轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的遷移率，鑒定出重組轉(zhuǎn)化子。三、實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)六得到的轉(zhuǎn)化子。四、儀器設(shè)備：電泳裝置。五、實(shí)驗(yàn)用具：96孔平板，牙簽。六、試劑 含抗生素LB平板 10 mM EDTA (pH8.0) 1 M KCl 10 x載樣緩沖液 0.8%瓊脂糖凝膠 2堿性裂解液：母液配制50 ml所需的量最終濃度4 M NaOH2.5 ml0.2 M10% SDS2.5 ml0.5 %蔗 糖15 g30%七、 實(shí)驗(yàn)步驟 1. 用牙簽從轉(zhuǎn)化選擇平板選取幾十個(gè)白色和幾個(gè)藍(lán)色菌落，殖在LB平板上，37過(guò)夜。 2. 在96孔平板每孔加入20 ml 10mM EDTA。 3. 用牙簽挑取少量菌體(不能太多)，懸浮于各孔中(其中12孔是藍(lán)色菌落作為對(duì)照)，將平板接觸旋渦器幾秒鐘。 4. 加入20 ml裂解液，將平板接觸旋渦器幾秒鐘，靜置5分鐘。 5. 將等量的1M KCl和載樣緩沖液混合，各孔中加入6 ml，將平板接觸旋渦器幾秒鐘。 6. 按藍(lán)色菌落，白色菌落.最后藍(lán)色菌落的順序，各取2030 ml點(diǎn)樣。 7. 電泳，觀察。與藍(lán)色菌落質(zhì)粒遷移率比較，可判別白色菌落的重組質(zhì)粒是否含有插入子。八、注意事項(xiàng)挑取菌落勿太少，也不能太多。此外，裂解后菌液較粘，點(diǎn)樣時(shí)吸管頭勿垂直拉出以免帶出點(diǎn)樣孔內(nèi)的菌液樣品。實(shí)驗(yàn)八 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)一、目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)。二、原理 PCR (Polymerase Chain Reaction)是80年代中發(fā)展起來(lái)的一種DNA特定片段體外擴(kuò)增技術(shù)。它已廣泛應(yīng)用于基因克隆、文庫(kù)構(gòu)建、DNA序列分析、生化檢測(cè)、基因定位等領(lǐng)域。最初PCR是用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段進(jìn)行，但Klenow片段高溫下迅速失活，因此每一輪反應(yīng)都需要加一份新酶，這不僅麻煩，還往往導(dǎo)致產(chǎn)量低，產(chǎn)物長(zhǎng)短不一等現(xiàn)象。隨后，從噬熱細(xì)菌(Thermas aquaticus)中分離到熱穩(wěn)定的Taq聚合酶，才解決了這一問(wèn)題。由于Taq DNA聚合酶高溫下穩(wěn)定，在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中不需要添加新的酶，從而保證了PCR技術(shù)的實(shí)用性，使其得以迅速發(fā)展。 PCR的原理及過(guò)程如下: (1) 將反應(yīng)體系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4種dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高溫(94)下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈；(2) 在低溫(3765)下退火，使引物與模板鏈3端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA；(3) 在中溫(72)下，通過(guò)Taq DNA聚合酶使引物從5端向3端延伸，隨著4種dNTP的摻入合成新的DNA互補(bǔ)鏈，完成第一輪變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)。反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增(見附圖)。循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個(gè)目的DNA分子經(jīng)20輪擴(kuò)增后，可達(dá)106。三、實(shí)驗(yàn)材料 重組質(zhì)粒DNA。四、儀器設(shè)備 DNA熱循環(huán)儀 電泳儀 電泳槽 紫外檢測(cè)儀 臺(tái)式離心機(jī)五、實(shí)驗(yàn)用具 0.5ml離心管10個(gè) 吸管頭若干個(gè) 微量取液器(20 ml)一支 1.5ml離心管20個(gè) 離心管架兩個(gè)六、試劑 1. 反應(yīng)緩沖液：由Taq酶供應(yīng)廠商提供。 2. 四種核苷酸混合物(dNTPs)：濃度為2 mM。 3. 寡核苷酸(PCR引物)：上游引物和下游引物(一般長(zhǎng)度為1720個(gè)核苷酸)。 4. Taq DNA聚合酶 5. 1.2% 瓊脂糖凝膠七、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 模板DNA的抽提：按堿裂解法抽提得到質(zhì)粒DNA。 2. PCR操作： (1) PCR反應(yīng)混合液的配制 （n為反應(yīng)數(shù)）： n x 2.0 ml反應(yīng)緩沖液(含15 mM MgCl2) n x 1.0 ml dNTPs (2 mM) n x 1.0 ml上游引物(5 mM) （引物在反應(yīng)液中的濃度通常為0.20.5mM） n x 1.0 ml下游引物(5 mM) n x 0.50.8單位Taq酶 加無(wú)菌水至總體積 n x 19 ml 每個(gè)PCR管中加入19 ml反應(yīng)混合液，1 ml稀釋質(zhì)粒DNA（2 ng），再加2滴礦物油，防止水分蒸發(fā)。稍離心。 含有重組質(zhì)粒的菌體也可直接用于PCR擴(kuò)增：用牙簽點(diǎn)取少量菌體在空的PCR管底部插幾下，加入反應(yīng)混合液和滴礦物油即可。注意：菌體不可太多，太多的菌體(即雜質(zhì))會(huì)抑制Taq酶的活性。(2) PCR反應(yīng)過(guò)程：94，1分鐘(預(yù)變性，可用STOP鍵或Pause鍵進(jìn)行) 94，30秒 55，1分鐘 35個(gè)循環(huán) 72，2分鐘 72，5分鐘 3. PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：取5 ml PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，然后放在紫外檢測(cè)儀下觀察，記錄結(jié)果。八、注意事項(xiàng) 由于PCR靈敏度非常高，所以應(yīng)當(dāng)采取措施以防反應(yīng)混合物受痕跡量DNA的污染。因而在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意下列事項(xiàng)： 1. 所有的與PCR有關(guān)的試劑，只作PCR實(shí)驗(yàn)用，而不挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。4. 特別注意防止引物受到用同一引物擴(kuò)增的DNA的污染。應(yīng)從引物母液中取一小部分稀釋成工作液作平常用，以避免污染引物母液。九、時(shí)間安排一個(gè)下午；PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)時(shí)，進(jìn)行植物DNA的抽提。實(shí)驗(yàn)九 植物DNA的抽提一、目的 掌握總DNA的抽提方法和原理。二、原理 植物的各個(gè)部位都可用作總DNA的抽提材料，但常用的材料為植物葉片和幼苗。為了獲得高純度的DNA，用作抽提材料的植物幼苗，最好先在黑暗的條件下放置幾天，以消除葉綠素的影響。 植物總DNA的抽提方法有多種，不同的植物都有最合適的抽提方法。但各種方法的基本原理都一樣，其原理是先用機(jī)械的方法使組織和細(xì)胞破碎，然后加入十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadeyltrimethyl ammomum bromide，簡(jiǎn)稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡(jiǎn)稱為SDS)等離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使細(xì)胞膜和核膜破裂，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的表面活性劑解聚核中的核蛋白(并與蛋白質(zhì)形成混合物)；再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白變性；經(jīng)離心除去植物的組織和變性蛋白；上清液中加入無(wú)水乙醇使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。三、實(shí)驗(yàn)材料：水稻葉片等植物材料。四、儀器設(shè)備 高速冷凍離心機(jī) 電泳裝置2套 液氮罐 高速臺(tái)式離心機(jī) 振蕩器1臺(tái)五、實(shí)驗(yàn)用具 1.5毫升離心管架1個(gè) 7毫升離心管架1個(gè) 50ml離心管架1個(gè) 玻璃滴管5支 研缽一套 紗布 離心管50 ml10、7 ml10、1.5 ml10 (離心管、吸頭及玻璃滴管均需消毒)六、試劑 無(wú)水乙醇, 70%乙醇 氯仿 瓊脂糖 TBE電泳緩沖液 TE緩沖液(pH 8.0) 10 mg/ml的RNase溶液 3 M乙酸鈉(NaAc) 限制性內(nèi)切酶(Pst I 或EcoR I) 抽提緩沖液(配制1升)： 母 液配制1升所需的量最終濃度 5 M NaCl 100 ml500 mM1 M Tris-HCl(pH 8.0) 100 ml100 mM500 mM EDTA(pH