大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)-QIAGEN大提試劑盒.doc

質(zhì)粒抽提一、溶液及培養(yǎng)基配制：1、LB液體培養(yǎng)基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L（2）配制：A、稱量：稱取培養(yǎng)基各成分所需量，置于燒杯中。B、溶化：加入所需水量2/3的蒸餾水于錐形瓶中，攪拌使藥品全部溶化。C、定容。D、加塞、包扎。F、高壓滅菌121，30min，滅菌后室溫保存?zhèn)溆?。若要分裝需要在超凈臺(tái)內(nèi)。G、培養(yǎng)基完全溶解，降至室溫后，加氨芐霉素（AMP）。先將AMP用三蒸水配制為100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培養(yǎng)基。（可以多配制一些，分裝為1ml/管）2、LB固體培養(yǎng)基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化鈉(NaCl) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L氨芐青霉素溶液 100g/ml（終濃度）（即100mg溶于1ml超純水或生理鹽水或PBS，再加入1000ml培養(yǎng)基）瓊脂粉 15g/L（2）配制：A、稱量：稱取培養(yǎng)基各成分所需量，置于燒杯中。B、溶化：加入所需水量2/3的蒸餾水于燒杯中，攪拌使藥品全部溶化。C、5mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.4。D、定容。E、分裝、加塞、包扎。F、高壓滅菌121，30min。G、滅菌后，將融化的LB固體培養(yǎng)基置與55的水浴中（或室溫），待培養(yǎng)基溫度降到55時(shí)（手可觸摸）加入抗生素，（免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效），并充分搖勻。（3）倒板： 一般20ml倒1塊板，培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開蓋子，水分晾干后蓋上蓋子并用封口膜封口，4保存?zhèn)溆?，使用前提前拿出，防止水蒸氣滴入板中。首要檢查是否有足夠的固體和液體LB培養(yǎng)基，基本上每個(gè)質(zhì)粒需要一塊固體培養(yǎng)基，小搖的2ml和大搖的250ml LB培養(yǎng)基。小搖的可以在一個(gè)50ml離心管中預(yù)備著，每次直接取用。轉(zhuǎn)化所需L形玻璃棒需確認(rèn)已滅菌 搖菌器申請(qǐng)，張?jiān)u滸老師，王雪師姐；注意：考慮到多種東西需要滅菌，可以在轉(zhuǎn)化之前或者小搖大搖那天一起滅菌。所有需要提前滅菌的東西有：足量液體LB培養(yǎng)基滅菌后加入AMP；藍(lán)黃白槍頭至少個(gè)一盒，備用；1.5ml doff管；Beckman離心機(jī)專用離心管；錫箔紙；250ml錐形瓶，500或者1000ml錐形瓶；電動(dòng)移液器所用移液管（可以考慮用5ml移液槍，則先滅菌5ml槍頭）；超純水和TE bufferStep1：轉(zhuǎn)化:事前準(zhǔn)備的：提前將固體培養(yǎng)基至于超凈臺(tái)中，使之回復(fù)室溫；滅過菌的L形玻棒，確認(rèn)微生物室有滅過菌的；滅過菌烘干的進(jìn)口1.5ml doff管足量；100L槍及滅菌黃槍頭（微生物室或許有），10L槍及滅菌白槍頭；Marker筆燒杯，溫度計(jì)小冰盒以及冰注意感受態(tài)融化需要時(shí)間，可以先將感受態(tài)取出融化的時(shí)間內(nèi)做其他準(zhǔn)備工作感受態(tài)提前半小時(shí)從-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰內(nèi)30min即可）。將冰箱里的固體培養(yǎng)基，滅過菌烘干的進(jìn)口1.5ml doff管，滅過菌的L形玻棒，槍及槍頭取出備用。感受態(tài)融化后將其分裝，50l/管（注意在加質(zhì)粒前在各個(gè)管子上標(biāo)注好要加入的質(zhì)粒名稱以防混淆）。每個(gè)管加3l質(zhì)粒，輕輕吹打均勻，冰上靜置30min 。42水浴放置90秒后迅速拿出，插到冰里。鋪板，每個(gè)質(zhì)粒鋪5l/板。放置過夜。所有操作盡量在超凈臺(tái)內(nèi)完成，避免雜菌污染。Step2：小搖及大搖事先準(zhǔn)備：滅過菌的加過AMP的LB液體培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)粒至少250ml左右；15ml離心管；滅過菌的250ml及500ml或1000ml錐形瓶滅過菌的白槍頭及槍；滅過菌的藍(lán)槍頭及槍；marker筆，醫(yī)用膠帶，封口膜，垃圾袋滅過菌的錫箔紙申請(qǐng)Beckman離心機(jī)，借Beckman離心機(jī)專用離心管，為第二天抽提做準(zhǔn)備1、觀察菌落生長(zhǎng)狀況，若無異常，準(zhǔn)備小搖。2、準(zhǔn)備LB液體培養(yǎng)基（滅菌，AMP），分裝至50ml離心管中（注明使用與否、加氨芐量、配制時(shí)間等），可在4度冰箱內(nèi)儲(chǔ)備使用；將15ml離心管上按待擴(kuò)增質(zhì)粒名稱做好標(biāo)記。3、從分裝的50ml離心管中，向15ml離心管中加入2ml液體LB（滅菌，AMP）培養(yǎng)基（注意盡量不要留在瓶壁上）。多余培養(yǎng)基使用后封口，4度保存。4、以孤立的菌落點(diǎn)為目標(biāo)，用槍頭（推薦白槍頭）刮取微量菌落，溶于2ml培養(yǎng)基中。將離心管蓋子擰松后用膠帶固定5、小搖，時(shí)間以具體情況定。一般從上午10點(diǎn)左右開始小搖，到當(dāng)天下午5點(diǎn)可以準(zhǔn)備大搖。6、封好固體培養(yǎng)基，放回4度冰箱，收拾好微生物室臺(tái)面，清理廢液缸及垃圾桶（為了以后能順利申請(qǐng)到）7、小搖成功后，液體LB（滅菌，AMP）培養(yǎng)基，每250ml分裝于500ml或1000ml錐形瓶中（瓶越大，培養(yǎng)基震蕩越充分），不需嚴(yán)格定量。將小搖完成的培養(yǎng)基加入大錐形瓶中（注意在瓶上做好相關(guān)標(biāo)記），滅菌過的錫箔紙包裹瓶口，大搖，過夜。Step3：質(zhì)粒抽提（大提，若為中提或小提具體看說明書）（使用進(jìn)口器材）注意及時(shí)申請(qǐng)Beckman離心機(jī)，除了20000g轉(zhuǎn)速必需，其余6000g轉(zhuǎn)速可以用張?jiān)u滸老師德爾Sigema離心機(jī)代替；準(zhǔn)備好試劑盒，檢查試劑盒中各個(gè)試劑是否足夠，每個(gè)質(zhì)粒Buffer P1（4度預(yù)冷）10ml，Buffer P210ml，BufferP3（4度預(yù)冷）10ml，Buffer QBT 10ml，BufferQC 60ml，Buffer QF15ml。準(zhǔn)備足量50ml離心管，每個(gè)質(zhì)粒至少需要7個(gè)離心管；準(zhǔn)備足量的滅菌doff管滅過菌的移液管及電動(dòng)移液器（若無，可用1000微升槍及滅過菌的藍(lán)槍頭代替）冰及冰盒1000微升槍及滅過菌的藍(lán)槍頭滅過菌的超純水，無水乙醇，未滅菌的TE buffer以及滅過菌的TE buffer（細(xì)胞房冰箱有，若無可用濾器制備一些），異丙醇，3M乙酸鈉1、 將大搖完成的瓶子中的培養(yǎng)基分裝到5個(gè)50ml離心管中，此時(shí)培養(yǎng)基渾濁。2、 Beckman離心機(jī)，Beckman離心管，6000g、4、15min。（提前一天申請(qǐng)離心機(jī)的使用），需分批離心。離心后盡快，小心地棄上清。3、 加入4預(yù)冷的Buffer P1 10ml，重懸大腸桿菌。由于菌分裝在若干離心管中，先將10ml加入一個(gè)離心管中，吹起沉淀的菌，吹勻，加到另一個(gè)離心管里，再吹，依次將菌全部收集到Beckman離心管。4、 加入Buffer P2 10ml，翻轉(zhuǎn)混勻4-6次，室溫（15-25）孵育5min。5、 加入4預(yù)冷的Buffer P3 10ml，翻轉(zhuǎn)混勻4-6次，冰上孵育20min。6、 離心，使裂解的大腸桿菌沉淀，20000g、4、30min。7、 將上清轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，二次離心，6000g、4、30min。8、 安裝QIAGEN-tip。*9、 向tip中加入10ml Buffer QBT，隨重力流下，以平衡tip。10、 小心加入第7步得到的上清，注意不能讓沉淀漂起，否則要再離心。隨重力流下。質(zhì)粒將留在樹膠濾器中。11、 向tip中加入230ml Buffer QC，隨重力流下12、 將15ml 65預(yù)熱的Buffer QF加入tip，于tip下安置50ml離心管，接濾出的液體，含質(zhì)粒。13、 向含質(zhì)粒的濾出液中加入10.5ml，即0.7倍QF體積的異丙醇，以使DNA沉淀。加入后6000g、4、1h。小心地棄去上清（注意離心之后立即倒凈異丙醇，否則沉淀將漂起）。14、 向50ml離心管加入400l未滅菌的TE buffer，吹起，溶解，轉(zhuǎn)移至1.5ml 進(jìn)口滅菌doff管。室溫靜置30min。15、 向doff管中加60l乙酸鈉和650l無水乙醇，出現(xiàn)沉淀。10000rpm，4-8，10min。（離心機(jī)預(yù)冷）16、 盡可能的吸去上清。加入75%乙醇1ml（已滅菌分裝的超純水250l+無水乙醇750l，混合于滅菌的進(jìn)口doff管，注意應(yīng)當(dāng)先在另一個(gè)滅菌doff管中配好，絕不可先向沉淀里加水，否則即便加了酒精，沉淀也很難析出），10000rpm，4-8，5min。盡可能吸去上清乙醇，然后重復(fù)以上離心，盡可能吸去上清乙醇。最后放置超凈臺(tái)中風(fēng)干（最大風(fēng)量約15-20min）。17、 加150l滅過菌的細(xì)胞房存放的TE buffer，溶解后封口膜封口，-4保存1-2天，待其完全溶解后測(cè)定吸光度。測(cè)定吸光度后-20保存。具體要求何種濃度為提取成功，依據(jù)后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要求而定（參考值為1g/ml）Step4 濃度測(cè)定1、 準(zhǔn)備比色皿，PCR用2.5l、100l槍及相應(yīng)滅過菌的進(jìn)口槍頭，面巾紙，新鮮的超純水。（注意防護(hù)，戴口罩，最好用酒精擦拭附近桌面，老師建議可以在超凈臺(tái)內(nèi)吸取所需質(zhì)粒提取液，取出來測(cè)）2、 打開儀器，選擇“DNA”，“Dilution”保持為“100”。若濃度較低，測(cè)不出濃度，則換稀釋比例“Set up”“enter”，選擇“Dilution”直接輸入50 “enter”，操作依舊，先調(diào)零，后測(cè)定，但是98L水+2L樣品。其他稀釋度如此。3、 洗