三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析.doc

. 畢 業(yè) 論 文題目：三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專 業(yè)： 層 次： 年 級(jí)： 完成日期： 指導(dǎo)教師： 三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析摘要目的探討肺炎支原體（MP）咽拭子快速液體培養(yǎng)法、咽拭子聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法和血清MP被動(dòng)凝集法（MP-Ab）等方法在兒童MP感染診斷治療過程中的敏感性方法采用3MP檢測(cè)法對(duì)362例臨床擬診呼吸道（非細(xì)菌性）感染的患兒的咽拭子和血清標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)研究，每患兒取咽拭子做快速培養(yǎng)和PCR，同時(shí)取血清做MP-Ab檢測(cè)，對(duì)3種方法的檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷治療病例進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果回顧臨床病例診斷MP感染患兒152例。MP快速培養(yǎng)法檢出陽性78例，陽性率為51.3%，病程為（4.52.6）天；PCR法檢測(cè)出陽性103例，陽性率為67.8%，病程為（6.23.5）天；MP-Ab法檢測(cè)出陽性127例，陽性率83.5%，病程（8.14.5）天。結(jié)論3種MP檢測(cè)法的敏感性與病程有相關(guān)性，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患兒病程選取檢測(cè)方法，以提高陽性檢出率和敏感性。關(guān)鍵詞 肺炎支原體，快速培養(yǎng)法，咽拭子聚合酶鏈反應(yīng)，血清抗體，配對(duì)研究 前言肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae,MP）是嬰幼兒、青少年急道感染的主要病原體之，臨床上表現(xiàn)為呼吸道感染綜合征，其中約3%10%可發(fā)展為支原體肺炎。但只根據(jù)臨床癥狀很難鑒別由MP或病毒、細(xì)菌等病原體引起的兒童呼吸道感染，給臨床治療帶來一定的困難。筆者采用3種MP檢測(cè)法對(duì)362例臨床擬診為呼吸道（非細(xì)菌性）感染患兒的咽拭子和血清標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)研究，通過病例回顧來探索對(duì)支原體肺炎敏感的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以協(xié)助臨床準(zhǔn)確做出診治。1.文獻(xiàn)綜述1.1肺炎支原體的定義小兒肺炎支原體肺炎多見于515歲兒童，嬰幼兒患病常表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎。多數(shù)為亞急性起病，發(fā)熱無定型，或體溫正常，咳嗽較重，初期為刺激性干咳，常有咽痛，頭痛等癥狀。X線改變明顯，多為單側(cè)病變，也可見雙側(cè)病變，以下葉為多見，有時(shí)病灶呈游走性，少數(shù)呈大葉性陰影；病程23周不等，X線陰影完全消失比癥狀消退更延長(zhǎng)23周之久，偶有延長(zhǎng)至6周者。1.2肺炎支原體的發(fā)病機(jī)制肺炎支原體肺炎（MycoplasmaPneumoniaePneumonia，MPP）的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制等學(xué)說，其中免疫調(diào)節(jié)異常在MPP的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用1.3肺炎支原體的臨床表現(xiàn)1.3.1多數(shù)為亞急性起病，發(fā)熱無定型，或體溫正常，咳嗽較重，初期為刺激性干咳，常有咽痛，頭痛等癥狀。1.3.2可出現(xiàn)多系統(tǒng)多器官的損害，皮膚粘膜表現(xiàn)為麻疹樣或猩紅熱樣皮疹；偶見非特異性肌痛和游走性關(guān)節(jié)痛；也有表現(xiàn)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)損害、血尿及溶血性貧血等。1.3.3全身癥狀比胸部體征明顯。體檢肺部體征不明顯，偶有呼吸音稍低及少許干濕羅音者1.4肺炎支原體的臨床診斷病原學(xué)診斷肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)法優(yōu)于被動(dòng)凝集法，在肺炎支原體肺炎感染的早期可提供重要的依據(jù)，可做為臨床診斷MP感染的優(yōu)先試驗(yàn)8；氣管肺泡灌洗液MP-DNA測(cè)定不僅能診斷MP感染,且支氣管肺泡灌洗術(shù)可促進(jìn)呼吸道癥狀的改善及體征恢復(fù)，且通過纖維支氣管鏡收集支氣管肺泡灌洗液MP-DNA，痰液MP-DNA及血清MP抗體檢測(cè)陽性率沒有差異。CRP的檢測(cè)是肺炎病原體的輔助診斷方法，一定程度可區(qū)分細(xì)菌性肺炎和支原體肺炎。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)MP具有可靠、特異性高的特點(diǎn)，逐漸成為早期特異診斷的有力武器。1.5肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室檢查急性期MPP患兒血清hs-CRP、C3、CA、IgM、IgG明顯升高，IgA明顯降低；而恢復(fù)期hs-CR、IgG仍然較高，而IgM和IgA均沒有明顯變化，補(bǔ)體C3、C4在恢復(fù)期內(nèi)也沒有明顯變化，因此血清C-反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白和血清補(bǔ)體的監(jiān)測(cè)對(duì)診斷急性期或恢復(fù)期MPP有重要意義。MP-IgM和冷凝集試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)可提高小兒支原體肺炎實(shí)驗(yàn)診斷的準(zhǔn)確率；支原體肺炎患兒外周血白細(xì)胞大多正常占80%，中性粒細(xì)胞增高占61%；65.6%患兒C-反應(yīng)蛋白增高；53.6%患兒血沉增快；58.4%患兒心肌酶譜增高；24.0%患兒肝酶增高；16.8%患兒尿酸增高。5流行病學(xué)特點(diǎn)及進(jìn)展MP肺炎發(fā)生率約為22.3%，912歲感染率最低,36歲最高,1012月是發(fā)病高峰月,小兒支原休肺炎發(fā)病率有所上升,發(fā)病年齡有趨小傾向,秋冬季發(fā)病率高,肺炎支原體只要通過呼吸道進(jìn)行傳播，尤其發(fā)病率較高的地區(qū)，局部區(qū)域每隔3-5年可發(fā)生一次肺炎支原體感染，每2-6年可發(fā)生一次大范圍的肺炎支原體感染，每次感染的時(shí)間都持續(xù)較長(zhǎng)，有的感染可持續(xù)一年左右，因此，有關(guān)部門一定要采取相應(yīng)的預(yù)防措施，切斷呼吸道飛沫傳播途徑對(duì)控制疾病發(fā)生和流行具有重大意義。控制支原體感染的發(fā)生和流行。2.材料和方法2.1樣本收集某中心醫(yī)院檢驗(yàn)科2015年1月1日8月6日在兒科就診住院患兒病例，有呼吸道感染癥狀，已經(jīng)初診為非細(xì)菌性感染的患兒362例作為研究對(duì)象，其中男175例，女187例；年齡為2個(gè)月12歲，病程為190天。2.2方法具體方法有：（1）用MP快速培養(yǎng)法、PCR法和MP-Ab法等3種MP檢測(cè)法對(duì)362例研究對(duì)象同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。（2）通過研究對(duì)象病歷回顧統(tǒng)計(jì)MP感染的例數(shù)，并按年齡、病程和3種MP檢測(cè)法結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.3臨床診斷MP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)1、臨床癥狀、體征標(biāo)準(zhǔn)，包括回顧性診斷即患兒經(jīng)紅霉素治療有效，經(jīng)青霉素、頭孢菌素治療無效者等；以及實(shí)驗(yàn)室檢查3種檢測(cè)法至少有一種陽性。病程計(jì)算方法：以病歷本記錄為準(zhǔn)，即在患兒開始有癥狀或體征時(shí)開始計(jì)算，到患兒來就診檢測(cè)時(shí)為止進(jìn)行計(jì)算。2.4MP快速培養(yǎng)法支原體分離鑒別培養(yǎng)液由珠海市浪峰生物技術(shù)有限公司提供。清晨患兒未洗漱用咽拭子取咽部分泌物，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，將咽拭子用無菌生理鹽水處理，接種到預(yù)溫的培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)；培養(yǎng)基液體顏色由紫紅色變?yōu)椴菥G色或嫩綠色且清亮，并且在靜置時(shí)，瓶底有藍(lán)色顆?；蛭镔|(zhì)沉淀為陽性，5天后培養(yǎng)基顏色不變或無藍(lán)色顆?；蛭镔|(zhì)沉淀為陰性。PCR法：試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。應(yīng)用PCR法檢測(cè)MP-DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，以在紫外燈下出現(xiàn)180bp擴(kuò)增帶結(jié)果判為陽性。每次試驗(yàn)均設(shè)陽性、陰性對(duì)照（陽性對(duì)照為MP質(zhì)粒，陰性對(duì)照為無菌生理鹽水），由專人進(jìn)行操作，質(zhì)量控制。MP-Ab法：試劑為日本瑞必歐株式會(huì)社MP-Ab檢測(cè)試劑SERODIA-MYCO凝集試驗(yàn)試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，抽取患兒靜脈血3ml，采用明膠顆粒被動(dòng)凝集法，用血清檢測(cè)，結(jié)果以140判斷為陽性。每次試驗(yàn)均設(shè)未致敏明膠顆粒、致敏明膠顆粒和陽性、陰性血清進(jìn)行測(cè)定。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，各年齡組與3種檢測(cè)方法結(jié)果比較用Spearman檢驗(yàn)；各年齡組間確診病例的陽性率比較用2檢驗(yàn)；3種檢測(cè)方法陽性結(jié)果與病程之間的比較用q檢驗(yàn)3.結(jié)果3.1陽性樣本經(jīng)過回顧性診斷，在配對(duì)研究組362例研究對(duì)象中有152例符合MP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即有152例確診病例，其中肺炎45例，支氣管炎56例，上呼吸感染49例，支氣管哮喘2例。MP快速培養(yǎng)法檢測(cè)出78例陽性，PCR法檢測(cè)出103例陽性，MP-Ab法檢測(cè)出127例陽性。3.2結(jié)果分析 各確診病例的年齡分布，見表1。表1顯示兒童MP感染的年齡以34歲年齡段的病例最多，為46例，陽性率最高，為70.77%，與其余年齡組段比較P0.05。不同病程患兒3種檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果，見表2，表2顯示MP快速培養(yǎng)法為陽性的患兒病程均值較短為（4.52.6）天，PCR法為陽性的患兒病程均值為（6.23.5）天，MP-Ab法為陽性的患兒病程均值較長(zhǎng)為（8.14.5）天。3組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。表1不同年齡組MP感染確診病例和3種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比分析注：代表與年齡組34歲組段比較結(jié)果表2不同病程患兒3種檢測(cè)方法陽性結(jié)果對(duì)比分析注：代表三組之間的兩兩比較4.討論4.1MP 感染的臨床表現(xiàn)常無特異性，臨床的實(shí)際工作中，容易與一般病毒性感冒相混淆。在臨床上患兒有下列癥狀：（1）發(fā)熱呈弛張熱或不規(guī)則熱。刺激性咳嗽非膿性痰，偶帶血絲。（2）可有咽痛、頭痛、胸痛，全身癥狀比體征明顯。（3）肺部體征不典型而胸片炎癥顯著，可見云霧狀大片陰影。（4）WBC正?；蛏?。（5）青霉素類、磺胺類抗生素治療無效，改用或一開始用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有效。（6）實(shí)驗(yàn)室MP檢驗(yàn)有1項(xiàng)或1項(xiàng)以上陽性具備以上2個(gè)條件或以上者可初步診斷為MP感染。多時(shí)候，臨床醫(yī)生為了盡快緩解患兒的癥狀，需根據(jù)患兒的癥狀、體征和病史做MP感染的診斷性治療，但應(yīng)與肺結(jié)核相互鑒別。4.2近年來由于診斷技術(shù)的提高，MP感染報(bào)道日漸增多，一般認(rèn)為MP感染以年長(zhǎng)兒發(fā)病較多，本文表1資料顯示，28歲年齡段是發(fā)病的高峰期2。占同期呼吸免疫科住院患兒的9.3%，比有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道各年齡組支原體肺炎占肺炎發(fā)病的10%20%低。說明MP感染的發(fā)病年齡有提前，且年齡越小，臨床表現(xiàn)愈不典型。4.3臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)MP的方法很多，過去所用的冷凝集試驗(yàn)法診斷MP感染缺乏特異性，敏感性也差，易受病程的影響3。本文采用配對(duì)資料研究，對(duì)疑為MP感染的患兒進(jìn)行3種MP檢測(cè)法，以探討MP快速培養(yǎng)法、PCR法和MP-Ab法等方法在兒童支原體肺炎診斷治療過程中的敏感性。提示臨床醫(yī)生根據(jù)患兒不同的病程選取不同的檢測(cè)方法，以提高實(shí)驗(yàn)室的陽性檢出率。4.4.MP快速培養(yǎng)法是利用MP生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基液體中指示劑顏色發(fā)生改變來判斷MP生長(zhǎng)；標(biāo)本中的其他支原體和細(xì)菌則因培養(yǎng)基中加入了青霉素和醋酸陀均被抑制。該法陽性結(jié)果可48h檢出。結(jié)果顯示，培養(yǎng)法陽性率為51.3%（78/152），低于另外兩種方法的陽性率?？赡芘c在檢測(cè)前患兒已經(jīng)用了MP敏感藥物有關(guān)。表2結(jié)果顯示，該法陽性病例病程最短。提示病程時(shí)間較短的患兒選擇此方法對(duì)檢測(cè)的陽性率較高。MP培養(yǎng)是診斷MP的金標(biāo)準(zhǔn)4。4.5.咽拭子PCR法檢測(cè)質(zhì)粒核酸，該法快速、敏感和特異，通過一技術(shù)可從患兒痰中檢測(cè)MP-DNA。由于此方法相當(dāng)敏感，易受污染，故實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)應(yīng)特別小心。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，該法的陽性率為67.76%（103/152），高于快培法。此法彌補(bǔ)了極微量的和被藥物殺死的MP不能通過快速培養(yǎng)法檢出的病例。表2結(jié)果顯示，該法陽性病例，病程為（6.23.5）天。詳細(xì)資料顯示，有病程在30天以上的患兒經(jīng)抗MP治療，該法仍可為陽性，說明MP的生存力相當(dāng)強(qiáng)，要系統(tǒng)化治療。血清MP-Ab法陽性率是3種檢測(cè)方法中最高的，為83.55%（127/152），該法是檢測(cè)患兒血清中的MP抗體，而非直截了當(dāng)檢測(cè)MP本身，因而陽性結(jié)果并不能確診是MP感染。對(duì)患兒狀態(tài)的綜合評(píng)估應(yīng)包括對(duì)患者臨床癥狀和試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)分析。極低量的抗體可能不被此試驗(yàn)檢測(cè)出來。另外還有些MP感染的患者不產(chǎn)生抗體或只產(chǎn)生少量的抗體，高抗體滴度的樣品要出現(xiàn)前帶現(xiàn)象。表2結(jié)果顯示，該法陽性病例，病程最長(zhǎng)，這是由于發(fā)病初期，機(jī)體中尚未產(chǎn)生抗體而不能被檢測(cè)出，提示發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)或經(jīng)過多種藥物治療過的患兒選擇此方法有較高的陽性率。此檢測(cè)法結(jié)果往往受抗體出現(xiàn)的時(shí)相及患兒年齡、機(jī)體免疫系統(tǒng)狀況等多方面的影響。5.結(jié)論臨床應(yīng)根據(jù)患兒的不同病程、不同年齡以及用藥情況來選取實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法，以提高M(jìn)P的陽性檢測(cè)率，以更好地結(jié)合臨