葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告.docx

生物學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)報(bào)告 葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì) 一、 提取與分離1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)應(yīng)用薄層色譜法分離葉綠體色素的實(shí)驗(yàn)方法。2、 實(shí)驗(yàn)原理提取：葉綠體色素為有機(jī)酯類(lèi)化合物，根據(jù)相似相容原理，常用有機(jī)溶劑提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。分離：薄層層析法是將吸附劑均勻的涂抹在玻璃板上形成一薄層，將此吸附劑薄層作為固定相，把待測(cè)分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的下端，然后用一定量的溶劑作流動(dòng)相，將薄層板的下端浸入到展開(kāi)劑中。流動(dòng)相通過(guò)毛細(xì)管作用由下而上逐漸浸潤(rùn)薄層板，并帶動(dòng)樣品在板上也向上移動(dòng)，樣品中各組成分在吸附劑和展開(kāi)劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、脫吸附、再吸附的過(guò)程。由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附能力大小不同，吸附能力強(qiáng)的物質(zhì)相對(duì)移動(dòng)慢一些，兒媳婦能力弱的物質(zhì)相對(duì)移動(dòng)快一些，從而使各組分有不同移動(dòng)速度而彼此分開(kāi)。3、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑（1）新鮮的菠菜葉；（2）體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，碳酸鈣粉末、展開(kāi)劑（3）缽體、漏斗、三角瓶、剪刀、點(diǎn)樣本、毛細(xì)管、層析缸、硅膠預(yù)制板、濾紙。4、 實(shí)驗(yàn)步驟（1） 色素提取液的制備取葉45片新鮮葉片，洗凈，擦干葉表面，去中脈剪碎，放入缽體中。加入少量碳酸鈣，加23ml體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，研磨至糊狀，再加入10ml乙醇，上清液過(guò)濾，殘?jiān)儆?0ml乙醇沖洗過(guò)濾。（2） 葉綠體色素的分離取硅膠預(yù)制板一個(gè)，用點(diǎn)樣毛細(xì)管取上述提取液，平行于硅膠板的短邊，距下邊緣1cm處用毛細(xì)管劃線(xiàn)，風(fēng)干，重復(fù)操作34次；在干燥的層析缸中加入適量展開(kāi)劑，高度0.5cm，將硅膠預(yù)制板帶有色素一端放入，使其下端浸入展開(kāi)劑中；當(dāng)色素較好分離，展開(kāi)劑前沿接近硅膠預(yù)制板的上端邊緣時(shí)，取出，畫(huà)線(xiàn)。Rf=斑點(diǎn)中心到原點(diǎn)距離/溶劑前沿到原點(diǎn)距離5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析從上至下為胡蘿卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946 葉綠素a（藍(lán)綠色）：Rf=5.35/7.35=0.728 葉綠素b（黃綠色）：Rf=4.95/7.35=0.673 葉黃素（黃色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素極性依次增大，與硅膠吸附能力依次增強(qiáng)。同時(shí)可見(jiàn)其他色素帶。表明葉綠體中色素不限于以上4種。二、 理化性質(zhì)1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證葉綠素的理化性質(zhì)。2、 實(shí)驗(yàn)原理葉綠素是一種有葉綠酸與甲醇形成的復(fù)合酯，故可發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見(jiàn)光分解。葉綠素中的Mg可以被H+取代而形成褐色的去鎂葉綠素，去鎂葉綠素遇銅則變成銅帶葉綠色。3、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑（1） 新鮮菠菜葉片，葉綠素提取液；（2） 刻度試管，小試管，試管架，水浴鍋，10ml移液管；（3） 95%乙醇，苯，醋酸銅粉末，5%稀鹽酸，醋酸醋酸銅溶液，氫氧化鈉甲醇溶液。4、 實(shí)驗(yàn)步驟（1） 光對(duì)葉綠素的破壞取兩支小試管，各加入2.5ml葉綠體色素提取液，一支放在陽(yáng)光下，另一支用錫紙包好，40分鐘后觀(guān)察；取實(shí)驗(yàn)一中薄層層析分離成的硅膠色譜板一個(gè)，按長(zhǎng)度方向?qū)⒁话胗缅a紙包好，放在陽(yáng)光直射下半小時(shí)，觀(guān)察。（2） 皂化作用取一支10ml刻度試管加入3ml葉綠體色素提取液，加入1ml氫氧化鉀甲醇溶液，充分搖勻；加入3ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1ml蒸餾水，輕輕搖勻，靜置。（3） H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用取兩支試管，分別加入5,ml葉綠素提取液，第二支中加入鹽酸，待溶液變褐色后，加入少量醋酸銅粉末，60C水浴加熱。取兩片新鮮葉子，放入試管中，加入醋酸醋酸銅溶液，90C水浴。（4） 熒光現(xiàn)象取一只小試管加入5ml葉綠素提取液，在直射光和反射光照射下觀(guān)察。5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（1）光對(duì)葉綠素的破換圖中兩只試管，左邊為對(duì)照組，右邊為實(shí)驗(yàn)組，在陽(yáng)光照射下40分鐘。可以看出，右側(cè)試管中提取液顏色較淺，是由于色素見(jiàn)光分解特別葉綠素受光影響更大。右側(cè)色素顏色稍淺。這個(gè)實(shí)驗(yàn)并不成功，主要原因是天氣，陰天陽(yáng)光照射不夠強(qiáng)。 (2)皂化作用分層現(xiàn)象明顯，上層黃色，下層綠色，第三層為乳白色。苯層中溶有葉黃素、胡蘿卜素，乙醇層中為皂化的葉綠素，下層為實(shí)驗(yàn)操作失誤造成的乳化現(xiàn)象。（3）H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用 左圖：左側(cè)為對(duì)照組，右側(cè)為褐色，是因?yàn)樯闪巳ユV葉綠素。右圖：左側(cè)為對(duì)照組，右側(cè)綠色加深，是由于變成銅代葉綠素，但由于醋酸銅量過(guò)多，有沉淀。 葉片幾分鐘后變黃，是因?yàn)樯闪巳ユV葉綠素，最終變成深綠色，是由于變成銅代葉綠素。 左圖為反射光，呈紅色，右圖為直射光，成綠色。 其主要原理是由于葉綠素有兩個(gè)不同的吸收峰。葉綠素吸收光的能力極強(qiáng)，如果把葉綠素的丙酮提取液放在光源與分光鏡之間，可以看到光譜中有些波長(zhǎng)的光被吸收了。因此，在光譜上就出現(xiàn)了黑線(xiàn)或暗帶，這種光譜叫吸收光譜。葉綠素吸收光譜的最強(qiáng)區(qū)域有兩個(gè)：一個(gè)是在波長(zhǎng)為640nm660nm