ELISA試劑的選用和質(zhì)檢.ppt

ELISA試劑的選用和質(zhì)檢 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心王露楠 影響試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒的選用試劑盒的質(zhì)檢方法目前試劑盒存在的問(wèn)題 影響試劑盒質(zhì)量的因素 1 原材料 1 固相材料商品ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板 其對(duì)ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異 2 抗原 自然抗原 合成抗原和基因重組抗原 純度 純度不高可致試劑盒的特異性不強(qiáng) 立體結(jié)構(gòu) 合成抗原一般都是多肽抗原 缺乏完整抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)決定簇 用于相應(yīng)的抗HCV和抗HIV抗體的檢測(cè)有可能導(dǎo)致結(jié)合上述決定簇的抗體漏檢 影響試劑盒質(zhì)量的因素 3 抗體多克隆抗體 多抗 制備簡(jiǎn)單 含針對(duì)抗原的多種決定簇 但抗體的親和力和特異性相對(duì)要低于單抗 且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區(qū)別 單克隆抗體 單抗 可無(wú)限大量的得到針對(duì)單一決定簇的抗體 缺點(diǎn)是結(jié)合的單一性 當(dāng)建立雙抗夾心ELISA測(cè)定方法時(shí) 如包被和指示抗體使用同一單抗 則由于結(jié)合位點(diǎn)的缺乏 很容易造成假陰性結(jié)果 尤其是在使用一步法時(shí) 鉤狀 效應(yīng) Hookeffect 的出現(xiàn) 因此 在使用單抗建立雙抗夾心ELISA方法時(shí) 包被和指示抗體常使用針對(duì)抗原的不同決定簇的單抗 包被抗體可為混合單抗 從而使得固相抗體在免疫測(cè)定中能更為完全地結(jié)合待測(cè)物中的特異抗原 影響試劑盒質(zhì)量的因素 4 酶結(jié)合物ELISA試劑盒的核心部分 通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性而定的 辣根過(guò)氧化物酶 HRP 易于提取 價(jià)格相對(duì)低廉 性質(zhì)穩(wěn)定 耐熱及有機(jī)溶劑的作用 與抗原或抗體偶聯(lián)后 活性很少受損失 堿性磷酸酶 ALP 堿性磷酸酶用于ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對(duì)其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶 影響試劑盒質(zhì)量的因素 5 色原底物 HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺 OPD 和四甲基聯(lián)苯胺 TMB 鄰苯二胺 OPD OPD被認(rèn)為是HRP最為敏感的色原底物之一 當(dāng)pH值降為1 0時(shí) 最大吸收波長(zhǎng)為492nm 顯色加深 因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng) OPD的缺點(diǎn)是其對(duì)機(jī)體具有致突變作用 四甲基聯(lián)苯胺 TMB 氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù) 試劑盒中常為已配好的A B兩種液態(tài)試劑 即一定濃度雙氧水溶液和TMB 它們?cè)谌芤褐邢鄬?duì)不穩(wěn)定 因此在使用ELISA試劑盒時(shí) 如底物A 或 和B出現(xiàn)顏色 或各取一滴混合后顯色 說(shuō)明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染 必須廢棄 影響試劑盒質(zhì)量的因素 2 試劑盒的方法學(xué)設(shè)計(jì)雙抗原夾心法測(cè)抗體 抗HIV Tp 影響試劑盒質(zhì)量的因素 間接法測(cè)抗體 抗HCV Tp 影響試劑盒質(zhì)量的因素 雙抗體夾心法測(cè)抗原 兩步法 影響試劑盒質(zhì)量的因素 雙抗體夾心法測(cè)抗原 一步法 影響試劑盒質(zhì)量的因素 3 試劑盒的運(yùn)輸和貯存ELISA試劑盒的效期一般為6個(gè)月 這是指在貯存溫度為2 8 C的情況下 但一個(gè)試劑盒從出廠至用戶(hù)手中 均要經(jīng)歷運(yùn)輸 如送檢 檢定 發(fā)貨等 及運(yùn)輸中的貯存 某一環(huán)節(jié)的不當(dāng) 均會(huì)影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量 試劑盒的選用 1 根據(jù)可能影響試劑盒質(zhì)量的因素 從以下幾個(gè)方面來(lái)判斷該試劑盒是否符合我們的要求效期固相材料的來(lái)源包被抗體或抗原的性質(zhì) 單抗 多抗或合成多肽或重組多肽 顯色底物 是TMB還是OPD 測(cè)定模式 一步法或二步法 試劑盒的選用 2 同行對(duì)有關(guān)試劑盒的使用效果個(gè)別的使用效果在實(shí)際工作中 其它實(shí)驗(yàn)室對(duì)某種試劑盒的實(shí)際使用效果 往往具有很強(qiáng)的說(shuō)服力 綜合的使用評(píng)價(jià)對(duì)一種試劑盒的綜合使用評(píng)價(jià) 是指多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)這種試盒實(shí)際應(yīng)用效果的綜合分析 ELISA試劑盒的質(zhì)檢 1 包裝 儲(chǔ)存狀態(tài)內(nèi)外包裝 效期 試劑瓶是否漏液 真空包裝是否破損 試劑是否齊全等等2 采用血清盤(pán) panel 質(zhì)檢血清盤(pán)由一定數(shù)量的陰 陽(yáng)性樣本組成 可用來(lái)判斷試劑盒的靈敏度 特異性和符合率 如HBsAg 抗HCV和抗HIV等血清盤(pán) ELISA試劑盒的質(zhì)檢 ELISA試劑盒的質(zhì)檢 HBsAg ELISA試劑盒的質(zhì)檢 抗HCV ELISA試劑盒的質(zhì)檢 TP ELISA試劑盒的質(zhì)檢 3 采用弱陽(yáng)性定值質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)檢對(duì)不同廠家或同一廠家不同批號(hào)試劑盒采用同一弱陽(yáng)性定值質(zhì)控血清檢測(cè) 可比較出不同廠家或不同批號(hào)試劑盒的檢測(cè)靈敏度 測(cè)定下限 的差異 對(duì)判斷試劑盒的質(zhì)量及其穩(wěn)定性具有重要的參考價(jià)值 檢驗(yàn)結(jié)果的正確與否 是試劑盒質(zhì)量 人員素質(zhì) 儀器設(shè)備狀態(tài)和室內(nèi)質(zhì)控措施等的綜合反應(yīng) 任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題 都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的失敗 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HCV 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HCV 試劑的不足之處1 主要是在低危人群中仍發(fā)現(xiàn)大量的不確定和假陽(yáng)性結(jié)果 再則仍有較長(zhǎng)的 窗口期 2 核心區(qū)抗原的減少程度把握不好的話 有可能會(huì)導(dǎo)致漏檢的發(fā)生 3 由于這些試劑所使用HCV抗原只是病毒的部份重組多蛋白或合成肽抗原 加之 固相對(duì)這些蛋白或多肽的吸附能力的局限性 使得固相上能捕獲抗體的抗原決定基的數(shù)量有限 從而影響測(cè)定的敏感性 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HCV 兩家試劑檢測(cè)結(jié)果不一致1 不同試劑廠家的ELISA試劑盒所用包被抗原的差異 目前抗HCV檢測(cè)ELISA試劑盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原 核心區(qū) NS3 NS4和NS5等 包被固相 以間接法進(jìn)行測(cè)定 由于上述HCV抗原的組合 來(lái)源及用量等方面的差異 2 所用包被抗原成份相互之間抗原決定簇的覆蓋 這種覆蓋將嚴(yán)重影響ELISA測(cè)定的敏感性 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HCV 對(duì)策 通常的做法是 初檢陰性的血袋再用與不同廠家的國(guó)產(chǎn)試劑復(fù)檢 如仍為陰性 血即為合格 或初檢使用國(guó)產(chǎn)ELISA試劑 復(fù)檢采用進(jìn)口試劑 對(duì)策 應(yīng)采取的辦法 在血站篩檢獻(xiàn)血員血時(shí) 初檢陰性尤其是S CO值較高的血液 最好使用不同ELISA試劑盒復(fù)檢 這樣才能最大程度的減少經(jīng)輸血HCV感染的發(fā)生 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HCV 抗HCVELISA出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要原因有 1 類(lèi)風(fēng)濕因子 RF 的干擾2 高免疫球蛋白血癥3 標(biāo)本中超氧化物歧化酶 SOD 的干擾4 用于固相包被的HCV基因工程抗原不純 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HIV 采用雙抗原夾心一步法檢測(cè)抗HIV 鉤狀效應(yīng) 所致的假陰性問(wèn)題 1 原因 HIV感染者中有些抗體滴度很高 采用可出現(xiàn)雙抗原夾心一步法檢測(cè) 可出現(xiàn)類(lèi)似雙抗體夾心一步法檢測(cè)抗原的 鉤狀效應(yīng) 現(xiàn)象 2 措施 在血站篩檢獻(xiàn)血員時(shí) 應(yīng)使用二步法試劑盒進(jìn)行檢測(cè) 或是對(duì)標(biāo)本進(jìn)行雙份同時(shí)檢測(cè) 一份原標(biāo)本 一份1 10或1 100稀釋標(biāo)本 從而避免漏檢 目前試劑盒存在的問(wèn)題 抗HIV ELISA測(cè)定結(jié)果的解釋1 一般來(lái)說(shuō) 一個(gè)感染HIV的患者 使用商品ELISA試劑盒測(cè)定 結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性 因?yàn)樵谶@些試劑盒中所用的包被抗原主要為gag編碼蛋白和病毒包膜蛋白 針對(duì)這些蛋白的抗體在HIV感染的機(jī)體免疫應(yīng)答中出現(xiàn)最早 而ELISA的測(cè)定敏感性足以將其早期測(cè)出 因此如果懷疑有可能的HIV感染 但ELISA測(cè)定結(jié)果為陰性 則HIV感染的可能性很小 2 實(shí)驗(yàn)操作或試劑有問(wèn)題或不能確定可能出現(xiàn)感染的確切日期 如果HIV抗體ELISA測(cè)定為陰性 就不必立即重復(fù)檢測(cè) 3 對(duì)于處于陽(yáng)性判斷值 Cut off 邊緣即稍低于Cut off的樣本 難于判斷是否為感染早期 或?qū)嶋H為非感染者的樣本 此時(shí) 可以再次取血測(cè)定和 或用另一種ELISA試劑盒檢測(cè) 從而明確測(cè)定結(jié)果 這種情況下 如果測(cè)定結(jié)果仍處于Cut off邊緣 則建議數(shù)月后再次測(cè)定 如仍無(wú)改變 則說(shuō)明無(wú)HIV感染 其它如免疫印跡 PCR測(cè)定HIVRNA也為此種情況下的HIV感染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 目前試劑盒存在的問(wèn)題 梅毒螺旋體抗體 檢測(cè)方法1 檢測(cè)非特異性抗體 使用類(lèi)脂質(zhì)抗原的血清學(xué)試驗(yàn) RPR TRUST2 檢測(cè)特異性抗體 使用密螺旋體抗原的血清學(xué)試驗(yàn)