MACS磁珠分選.doc

MACS磁珠分選免疫磁珠法分離細胞原理免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。一、 磁性細胞標記方式應用MACS技術進行磁性細胞分選最重要的一點是高質(zhì)量的標記。要盡可能地增強陽性細胞的標記，并減弱背景染色。有兩種基本的磁性標記方式：直接標記和間接標記。1、直接磁性細胞標記（Direct magnetic cell labeling）（磁珠結(jié)合的細胞就是所要分離獲得的細胞）直接標記是最快速、最特異的磁性標記方法。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長類細胞的MACS直標微珠可供選用。2、間接磁性細胞標記（Indirect magnetic cell labeling）（磁珠結(jié)合不需要的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞）間接磁性細胞標記需要聯(lián)合使用單克隆或者多克隆抗體和MACS間標微珠。未結(jié)合抗體、生物素化抗體或者熒光素標記抗體均可作為一抗標記細胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標記細胞。幾乎針對任何種系任何細胞的任何一種單抗或多抗，均可用于間接標記。間接標記主要在如下情況時選用：當沒有直標磁珠時；需要用幾種抗體的混合物同時分選或去除多種類型的細胞；間接標記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達弱的目的細胞時使用；使用自備抗體或者配體的磁珠分選中。（一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。）二、MACS分選策略有兩種基本的分選策略陽性分選和去除分選。復合分選策略是將兩種基本分選策略相結(jié)合或者聯(lián)合使用多選微珠，從而實現(xiàn)細胞亞群的分選。1、陽性分選策略（Positive selection strategy）陽性分選中，目的細胞被磁性標記后，作為陽性標記組分直接分選出來。分選后的細胞不必去除MACS微珠，可立即用于培養(yǎng)或者后續(xù)操作。該方法可以將磁性標記的靶細胞富集10000倍。陽性分選策略優(yōu)點：純度高，回收率高，操作迅速、簡便。2、去除分選策略（Depletion strategy）去除分選是把非目的細胞磁性標記后從細胞混合物中去除的方法，即未磁性標記的細胞為目的細胞。MACS分選柱技術加上強磁性標記可以去除高達4個對數(shù)級的細胞。去除分選策略適用范圍：去除不需要的細胞；缺乏針對目的細胞的特異性抗體（如腫瘤細胞）；不需要抗體和目的細胞結(jié)合，即細胞不被激惹（如T細胞、B細胞、NK細胞功能分析）；復合分選的一部分。 3、復合分選策略聯(lián)合使用兩種以上分選策略，主要用于細胞亞群的分選或者得到高純度非常稀有的細胞。（1）去除后再陽性分選（Depletion followed by positive selection）細胞亞群的分選，可以先磁性標記非目的細胞，去除分選后對陰性組分再行磁性標記和陽性分選。適用范圍：在細胞懸液中，非目的細胞也表達用來陽性選擇目的細胞的抗原，就需要先去除這群非目的細胞；如果要分選非常稀有細胞，先從細胞懸液中去除非目的細胞，在富集細胞的基礎上，進行陽性分選，可獲得高純度目的細胞。（2）多重分選策略（MultiSort Strategy）MACS多重分選是一種根據(jù)多種表面標志磁性分選細胞的技術。多重分選中，首先用MACS多選微珠標記目的細胞，進行第一參數(shù)陽性分選。然后細胞與多選解離試劑共同孵育，后者可以將微珠從抗體上酶性解離下來。接著使用針對另一細胞表面標志的抗體微珠復合物磁性標記陽性分選細胞。二次標記的細胞可以再次進行陽性分選或者去除分選。三、磁分離細胞的重要指標純度和得率，這取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會影響細胞活性，也無法直接上流式。四、目前市場上有2種磁性細胞分離系統(tǒng)1、Small particles (50 nm) MACS2、Large particles (12004500 nm) others（如Dynal）五、小磁珠1、優(yōu)點（1）對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。（2）可直接上流式檢測，不影響散射光。2、缺點（1）需要很強的磁場來分離細胞。（2）分離速度很慢，得率不高。（3）一次性的分離柱，不能在普通試管進行。（4）成本昂貴。六、大磁珠1、優(yōu)點（1）技術簡單，分離可在試管中完成。（2）易于增減細胞用量。（3）速度快，得率高（4）成本低2、缺點（1）對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于分離后培養(yǎng)。（2）純度低。（3）容易阻塞FCM的噴嘴。磁珠分選細胞注意事項磁珠分選細胞注意事項1、待分選細胞中如有貼壁細胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除，或者提高EDTA濃度。2、抗體包被磁珠對死細胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細胞。3、新鮮分離骨髓細胞，先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化，可使細胞團塊解聚，從而提高分離效率。 4、上分離柱前，充分振蕩，混懸細胞，打散細胞團塊。5、用分離柱分選，應用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯。6、細胞懸液加入分離柱中時，應將滴管伸至底壁后加入，避免將細懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細胞，以致后繼洗柱過程中，因疏忽末被洗下，最后導致純度不高。洗柱時，應在前次液體充分流盡后，再加洗液。 7、分選細胞量應根據(jù)說明書控制，不超量。8、孵育時間和溫度應按說明書進行，延長孵育時間、提高溫度會增加非特異結(jié)合。9、先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結(jié)合。免疫磁珠分離法用的分離柱不同的廠家生產(chǎn)的磁珠的大小，性能有可能不同。比如MACS的磁珠小，用分離柱分離。而BD產(chǎn)的磁珠是中號的，磁力大，不用分離柱，普通小試管加上分離器就可以分離細胞。如果都是用分離柱，廠商不同的話，最好看看說明，磁珠大小，磁力等性狀如何，是否相似。當然，最好還是試一下就知道了。（除了美天旎的是小磁珠，別的幾乎都是大磁珠）我曾經(jīng)清洗后重復利用的分離柱，感覺死的細胞會增加?？磳嶒炐枰耍詈糜眯碌?。MACS 的根Dynal的不一樣，MACS 是一個磁性column，而Dynal 只是外面依個磁性的eppendorf 座而已。Miltenyi的柱子回收方法 準備使用回收的柱子時，抗體孵育始，即將柱子置于新鮮的75%酒精中，柱的容器內(nèi)盛滿酒精，自動流下，既消毒，又de-gas，去除氣泡十分關鍵。洗抗體時，即開始洗柱子，將回收柱架于消毒過的長試管口上。換新的酒精自然滴下，換PBS+0.1%FBS沖洗之，最后用MACS Buffer沖洗。柱子準備完畢，準備上柱的細胞也就同時