MACS磁珠分選.doc

MACS磁珠分選免疫磁珠法分離細(xì)胞原理免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。一、 磁性細(xì)胞標(biāo)記方式應(yīng)用MACS技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選最重要的一點(diǎn)是高質(zhì)量的標(biāo)記。要盡可能地增強(qiáng)陽性細(xì)胞的標(biāo)記，并減弱背景染色。有兩種基本的磁性標(biāo)記方式：直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。1、直接磁性細(xì)胞標(biāo)記（Direct magnetic cell labeling）（磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞）直接標(biāo)記是最快速、最特異的磁性標(biāo)記方法。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長類細(xì)胞的MACS直標(biāo)微珠可供選用。2、間接磁性細(xì)胞標(biāo)記（Indirect magnetic cell labeling）（磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞）間接磁性細(xì)胞標(biāo)記需要聯(lián)合使用單克隆或者多克隆抗體和MACS間標(biāo)微珠。未結(jié)合抗體、生物素化抗體或者熒光素標(biāo)記抗體均可作為一抗標(biāo)記細(xì)胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標(biāo)記細(xì)胞。幾乎針對任何種系任何細(xì)胞的任何一種單抗或多抗，均可用于間接標(biāo)記。間接標(biāo)記主要在如下情況時選用：當(dāng)沒有直標(biāo)磁珠時；需要用幾種抗體的混合物同時分選或去除多種類型的細(xì)胞；間接標(biāo)記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達(dá)弱的目的細(xì)胞時使用；使用自備抗體或者配體的磁珠分選中。（一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。）二、MACS分選策略有兩種基本的分選策略陽性分選和去除分選。復(fù)合分選策略是將兩種基本分選策略相結(jié)合或者聯(lián)合使用多選微珠，從而實現(xiàn)細(xì)胞亞群的分選。1、陽性分選策略（Positive selection strategy）陽性分選中，目的細(xì)胞被磁性標(biāo)記后，作為陽性標(biāo)記組分直接分選出來。分選后的細(xì)胞不必去除MACS微珠，可立即用于培養(yǎng)或者后續(xù)操作。該方法可以將磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞富集10000倍。陽性分選策略優(yōu)點(diǎn)：純度高，回收率高，操作迅速、簡便。2、去除分選策略（Depletion strategy）去除分選是把非目的細(xì)胞磁性標(biāo)記后從細(xì)胞混合物中去除的方法，即未磁性標(biāo)記的細(xì)胞為目的細(xì)胞。MACS分選柱技術(shù)加上強(qiáng)磁性標(biāo)記可以去除高達(dá)4個對數(shù)級的細(xì)胞。去除分選策略適用范圍：去除不需要的細(xì)胞；缺乏針對目的細(xì)胞的特異性抗體（如腫瘤細(xì)胞）；不需要抗體和目的細(xì)胞結(jié)合，即細(xì)胞不被激惹（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞功能分析）；復(fù)合分選的一部分。 3、復(fù)合分選策略聯(lián)合使用兩種以上分選策略，主要用于細(xì)胞亞群的分選或者得到高純度非常稀有的細(xì)胞。（1）去除后再陽性分選（Depletion followed by positive selection）細(xì)胞亞群的分選，可以先磁性標(biāo)記非目的細(xì)胞，去除分選后對陰性組分再行磁性標(biāo)記和陽性分選。適用范圍：在細(xì)胞懸液中，非目的細(xì)胞也表達(dá)用來陽性選擇目的細(xì)胞的抗原，就需要先去除這群非目的細(xì)胞；如果要分選非常稀有細(xì)胞，先從細(xì)胞懸液中去除非目的細(xì)胞，在富集細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)行陽性分選，可獲得高純度目的細(xì)胞。（2）多重分選策略（MultiSort Strategy）MACS多重分選是一種根據(jù)多種表面標(biāo)志磁性分選細(xì)胞的技術(shù)。多重分選中，首先用MACS多選微珠標(biāo)記目的細(xì)胞，進(jìn)行第一參數(shù)陽性分選。然后細(xì)胞與多選解離試劑共同孵育，后者可以將微珠從抗體上酶性解離下來。接著使用針對另一細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體微珠復(fù)合物磁性標(biāo)記陽性分選細(xì)胞。二次標(biāo)記的細(xì)胞可以再次進(jìn)行陽性分選或者去除分選。三、磁分離細(xì)胞的重要指標(biāo)純度和得率，這取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大?。ù判裕欢蟮拇胖闀绊懠?xì)胞活性，也無法直接上流式。四、目前市場上有2種磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)1、Small particles (50 nm) MACS2、Large particles (12004500 nm) others（如Dynal）五、小磁珠1、優(yōu)點(diǎn)（1）對細(xì)胞溫和，不影響分離細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)。（2）可直接上流式檢測，不影響散射光。2、缺點(diǎn)（1）需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞。（2）分離速度很慢，得率不高。（3）一次性的分離柱，不能在普通試管進(jìn)行。（4）成本昂貴。六、大磁珠1、優(yōu)點(diǎn)（1）技術(shù)簡單，分離可在試管中完成。（2）易于增減細(xì)胞用量。（3）速度快，得率高（4）成本低2、缺點(diǎn)（1）對細(xì)胞造成機(jī)械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng)。（2）純度低。（3）容易阻塞FCM的噴嘴。磁珠分選細(xì)胞注意事項磁珠分選細(xì)胞注意事項1、待分選細(xì)胞中如有貼壁細(xì)胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除，或者提高EDTA濃度。2、抗體包被磁珠對死細(xì)胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細(xì)胞。3、新鮮分離骨髓細(xì)胞，先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化，可使細(xì)胞團(tuán)塊解聚，從而提高分離效率。 4、上分離柱前，充分振蕩，混懸細(xì)胞，打散細(xì)胞團(tuán)塊。5、用分離柱分選，應(yīng)用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯。6、細(xì)胞懸液加入分離柱中時，應(yīng)將滴管伸至底壁后加入，避免將細(xì)懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細(xì)胞，以致后繼洗柱過程中，因疏忽末被洗下，最后導(dǎo)致純度不高。洗柱時，應(yīng)在前次液體充分流盡后，再加洗液。 7、分選細(xì)胞量應(yīng)根據(jù)說明書控制，不超量。8、孵育時間和溫度應(yīng)按說明書進(jìn)行，延長孵育時間、提高溫度會增加非特異結(jié)合。9、先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結(jié)合。免疫磁珠分離法用的分離柱不同的廠家生產(chǎn)的磁珠的大小，性能有可能不同。比如MACS的磁珠小，用分離柱分離。而BD產(chǎn)的磁珠是中號的，磁力大，不用分離柱，普通小試管加上分離器就可以分離細(xì)胞。如果都是用分離柱，廠商不同的話，最好看看說明，磁珠大小，磁力等性狀如何，是否相似。當(dāng)然，最好還是試一下就知道了。（除了美天旎的是小磁珠，別的幾乎都是大磁珠）我曾經(jīng)清洗后重復(fù)利用的分離柱，感覺死的細(xì)胞會增加?？磳嶒炐枰?，最好用新的。MACS 的根Dynal的不一樣，MACS 是一個磁性column，而Dynal 只是外面依個磁性的eppendorf 座而已。Miltenyi的柱子回收方法 準(zhǔn)備使用回收的柱子時，抗體孵育始，即將柱子置于新鮮的75%酒精中，柱的容器內(nèi)盛滿酒精，自動流下，既消毒，又de-gas，去除氣泡十分關(guān)鍵。洗抗體時，即開始洗柱子，將回收柱架于消毒過的長試管口上。換新的酒精自然滴下，換PBS+0.1%FBS沖洗之，最后用MACS Buffer沖洗。柱子準(zhǔn)備完畢，準(zhǔn)備上柱的細(xì)胞也就同時