《菌種分離篩選》PPT課件

第六章微生物菌種的分離篩選 第一節(jié)菌種分離的總體設計第二節(jié)分離樣本的采樣第三節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng)第四節(jié)微生物的培養(yǎng)分離 第一節(jié)菌種的分離簡介 一 菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位 高等院校 工廠或菌種保藏部門索取或購買 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 二 分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求 菌種的特性 采用各種篩選方法 快速 準確地把所需要的菌種挑選出來 實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌 也必須重新進行分離純化 有了優(yōu)良的菌種 還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合 定方案 首先要查閱資料 了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性 采樣 有針對性地采集樣品 增殖 人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 在數(shù)量上占優(yōu)勢 分離 利用分離技術得到純種 發(fā)酵性能測定 進行生產性能測定 這些特性包括形態(tài) 培養(yǎng)特征 營養(yǎng)要求 生理生化特性 發(fā)酵周期 產品品種和產量 耐受最高溫度 生長和發(fā)酵最適溫度 最適pH值 提取工藝等 三 新種分離與篩選的步驟 菌種篩選主要步驟 調查研究及查閱充分的資料 設計實驗方案 確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境采樣 確定特定的增殖條件增殖培養(yǎng) 確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的 定性或半定量快速檢出法平板分離 原種斜面 確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎條件篩選 初篩 1株1瓶 復篩 1株3 5瓶 結合初步工藝條件摸索再復篩 1株3 5瓶 3 5株 單株純種分離 生產性能試驗 毒性試驗菌種鑒定 第二節(jié)分離樣本的采樣 1 采樣對象以采集土壤為主 一般園田土和耕作過的沼澤土中 以細菌和放線菌為主 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 酵母和霉菌較多 如一些野果生長區(qū)和果園內 采樣的對象也可以是植物 腐敗物品 某些水域等 從自然界篩選 2 采樣季節(jié) 以溫度適中 雨量不多的秋初為好 3 采土方式 在選好適當?shù)攸c后 用小鏟子除去表土 取離地面5 15cm處的土約10g 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 扎好 標記 記錄采樣時間 地點 環(huán)境條件等 以備查考 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 宜將樣品逐步分批寄回 以便及時分離 二根據(jù)微生物生理特點采樣1 根據(jù)微生物營養(yǎng)類型2 根據(jù)微生物生理特性 三特殊環(huán)境下采樣 第三節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種 讓無關的微生物至少是在數(shù)量上不要增加 可以通過配制選擇性培養(yǎng)基 選擇一定的培養(yǎng)條件來控制 一 控制培養(yǎng)基的成分例如碳源利用的控制 可選定糖 淀粉 纖維素 或者石油等 以其中的一種為唯一碳源 那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長 而其它微生物就可能死亡或淘汰 這樣對下階段的純種分離就會順利得多 二 控制培養(yǎng)條件pH值的控制細菌 放線菌 pH7 0 7 5酵母菌 真菌 pH6 5 7 0溫度的控制通氣量的控制 三抑制不需要的菌類如使用不同類型的抗生素 高溫 高壓等條件 抑制不需要的菌類 第四節(jié)微生物的培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著 但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài) 因此還必須分離 純化 在這 步 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應進一步應用 而且控制得細一點 好一點 純種分離的方法有劃線分離法 稀釋分離法 1 稀釋平皿分離法 1 稀釋平皿分離法 100ml 1g 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 1 100 1 1000 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 稀釋 1 稀釋平皿分離法 b 涂布平皿分離法 a 傾注平皿分離法 2 平皿劃線分離法a 連續(xù)劃線分離法b 分區(qū)劃線分離法 四 篩選 這一步是采用與生產相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗 以求得適合于工業(yè)生產用菌種 五 毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產毒的 將其作為生產菌種應當十分當心 尤其與食品工業(yè)有關的菌種 更應慎重 據(jù)有的國家規(guī)定 微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外 其他微生物作為食用 均需通過兩年以上的毒性試驗 培養(yǎng)分離 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎的步驟 到目前為止 還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株 在工業(yè)微生物篩選過程中 應及時調整檢測方法 以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應 因此 建立一更為科學的和針對性不強的分離方法是必要的 一 成功的分離培養(yǎng)方法 1 認真考察所需產品的特征和生產過程 2 制訂初步的篩選標準 3 將生態(tài)學方法運用到分離和篩選過程 三 將生態(tài)學方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點 1 羅列出所要分離的微生物類群 2 根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù) 描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地 3 將若干樣本分成若干類型 如植物和植物各部 土壤 類型和土層 巖石 水 昆蟲和發(fā)酵食品等 4 羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù) 如pH 鹽分 水分 氧化還原電勢及溫度等 5 列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物 如森林土壤中的幾丁質 葡萄表皮的果膠 6 根據(jù)上述1 5項中所獲得的數(shù)據(jù) 設計分離方法 即選擇適宜的稀釋液 底物 試樣 天然浸出汁和培養(yǎng)條件 7 用標準方法作對照來評價生態(tài)學分離方法 8 根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要 修改已知的方法 9 運用特定的富集方法 富集那些可能具有篩選意義的微生物類群 四 自然界中細菌的分離 一 采樣和采集方法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群 特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時 必須十分重視樣本的采集 樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟 土樣采集器 鑷子 解剖刀 手套 無菌小塑料袋和塑料瓶等 采樣的注意事項 1 采樣時應盡可能保持相對無菌 2 所采集的樣本必須具有某種代表性 3 采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期 地點以及采集地點的地理 生態(tài)參數(shù)等 4 應充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素 因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的 5 采好的樣應及時處理 暫不能處理的也應貯存于4 下 但貯存時間不宜過長 這是因為一旦采樣結束 試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境 其內部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化 微生物群體之間就會出現(xiàn)消長 二 生態(tài)學參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則 1 加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量 環(huán)境生物物理學參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數(shù)量和種類 2 就分離培養(yǎng)基的組成而言 部分培養(yǎng)基中必須含有10 50 的天然提取物 加入培養(yǎng)基中的天然提取物 部分培養(yǎng)基中則應含有多種碳 氮源 如幾丁質 纖維素或果膠 3 所有分離培養(yǎng)基中都應含有抗真菌劑 如放線菌酮和制霉素 摻加濃度一般為50 g m1 以抑制真菌的生長 4 瓊脂平板在使用前應置于37 培養(yǎng)箱中孵育l 2天 5 培養(yǎng)基的生物物理學參數(shù) 如pH及鹽分也應調節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近 二 分離 目的微生物不純 需分離純化 采用簡便迅速 有一定準確性的檢出方法 提高篩選效率 常用平皿反應法 紙片培養(yǎng)顯色法 浸有指示劑濾紙 透明圈法 混濁底物被分解后形成透明圈 如可溶性淀粉 碳酸鈣等 變色圈法 直接用顯色劑或指示劑 生長圈法 利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌 要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長 形成生長圈 抑制圈法 瓊脂塊培養(yǎng)法 用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株 羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物 抗生素篩選 檢定菌培養(yǎng) 加上發(fā)酵液 五 放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的 除嗜溫性放線菌外 其他放線菌一般在培養(yǎng)4 20天內在分離平板上緩慢形成菌落 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮 以抑制真菌的繁殖 選擇性地添加抗生素 分離瓊脂平板制備好后 一般皆應在37 培養(yǎng)箱中存放3天 放線菌的分離 土樣中放線菌的非選擇性分離 土樣風干 磨碎 無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng) 植物體上放線菌的分離 無菌取植物組織 干燥以減少細菌數(shù)量 剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng) 也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng) 水中放線菌的分離 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多 一般將水樣離心或濾紙過濾 取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布 次代培養(yǎng)及純化 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異 作初步的鑒定和區(qū)分 通過高倍放大進行鏡檢 可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基 而肉眼識別不同的生長形態(tài) 從而初步地加以鑒定 在分離放線菌時顯得尤為重要 將分離平板上所形成的菌落用經火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取 點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng) 以進一步篩選和分離 放線菌菌落形態(tài) 六 真菌分離 1 利用低碳 氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散 利于計數(shù) 分離和鑒定 這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢 并由此限制真菌的遷徙生長 2 改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離 3 有時 真菌子實體形成必須有光線 這在分離培養(yǎng)時應加以考慮 4 選擇性富集 是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術 富集可以是種水平的 如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌 也可以是組成群水平的 如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物 5 在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成 真菌的分離方法 土中真菌的分離 稀釋法 混入法 壓貼法 粘附法 浮選法 注射器采集法 土過篩法 庶糖密度梯度離心法 植物材料中真菌的分離 植入法 壓貼法 洗滌法 浸泡法 水中真菌的分離 水樣稀釋后涂布分離 餌誘技術常用于水中真菌的富集 子實體直接分離培養(yǎng)擔子菌 新采集的子實體組織植入平板內或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng) 微生物菌種分離實例 分解纖維素的微生物的分離實驗目的從土壤中分離能分解纖維素的微生物 純化得到1 5株菌 并通過此次實驗 培養(yǎng)以下三方面的能力 1 基本技術訓練 在目前專業(yè)課程學習基礎上進一步練習培養(yǎng)基的配制 干濕熱滅菌 以及微生物分離純化技術 2 初步的科研訓練 練習科研過程中查閱資料 設計實驗方案 動手實施方案 綜合安排實驗 解決臨時實際困難等方面的基本能力 認識科研程序 感受科研樂趣和困難 3 培養(yǎng)實事求是的工作作風 科學嚴謹?shù)墓ぷ鲬B(tài)度 實驗原理纖維素與纖維素酶纖維素酶是一種復合酶 一般認為至少包含三部分 C1 Cx 和葡萄糖苷酶組成 前兩種使纖維素分解成纖維二糖 第三種將纖維二糖分解成葡萄糖 正是在這三種酶的協(xié)同作用下 纖維素最終被分解成葡萄糖 為微生物的生長提供營養(yǎng) 纖維素分解菌的篩選纖維素 剛果紅混合培養(yǎng)基 剛果紅染色法常用的剛果紅染色法有兩種 一是先培養(yǎng)微生物 再加入剛果紅進行顏色反應 二是倒平板時就加剛果紅 方法一是傳統(tǒng)的方法 缺點是操作繁瑣 加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜 其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用 方法二的優(yōu)點是操作簡便 不存在菌落混雜問題 缺點是由于實驗材料和瓊脂都含有淀粉類物質 可以使能夠產生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應 但這種只產生淀粉酶的微生物產生的透明圈較為模糊 無明顯影響 方法二的另一缺點是 有些微生物具有降解色素的能力 它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈 與纖維素分解菌不易區(qū)分 短時間培養(yǎng)也無大礙 1 實驗材料及方法1 1樣品 從校園找到的竹子下的土壤 松樹下的土壤 混合土 熊貓糞 牛糞 1 2實驗所用的器材 培養(yǎng)皿 250mL錐形瓶 無菌稱量瓶 濾紙 藥匙 1mL和10mL的移液管 電子秤 無菌培養(yǎng)皿 涂布器 解剖鏡 顯微鏡 接種針 溫箱等 1 3實驗用培養(yǎng)基配方及配制注意事項1 3 1 選擇培養(yǎng)基 纖維素分解細菌 赫奇遜培養(yǎng)基 CMC KH2PO41 0g MgSO4 7H2O0 3g NaCl0 1g FeCl30 01g NaNO32 5g 水1000mL pH7 2 7 4 瓊脂20g 剛果紅 纖維素分解放線菌培養(yǎng)基 CMC KNO31 00g KH2PO40 50g MgSO4 7H2O0 50g NaCl0 50g 10 FeSO42滴 H2O1000mL pH7 2 7 4 瓊脂20g 剛果紅 纖維素分解真菌培養(yǎng)基 CMC 馬鈴薯200gKH2PO43 00g MgSO4 7H2O1 50g 蛋白胨0 50g VB12丸 瓊脂20 00g H2O1000mL pH6 0 6 5 瓊脂20g 纖維素分解菌 混合 的選擇培養(yǎng)基 纖維素粉5g NaNO31g Na2HPO31 2g KH2PO30 9g MgSO40 5g KCl0 5g 酵母膏0 5g 水解酪素0 5g 以上物質溶解后蒸餾水定容到1000ml1 3 2 鑒別及純化培養(yǎng)基 半固體 鑒別培養(yǎng)基的成分 NH4 2SO42g MgSO40 5g K2HPO41g NaCl0 5g 剛果紅0 4g 水1000mL 瓊脂5g 自然pH值 剛果紅 濾紙片 去淀粉 注 需無菌操作 配制時先配含無機鹽的半固體培養(yǎng)基 滅菌倒平板后 平鋪入用剛果紅染色的無菌去淀粉濾紙片 1 4實驗方法與步驟 取樣 菌懸液的制備 將菌懸液涂布到有選擇與鑒定作用的培養(yǎng)基 含剛果紅 上 挑選單菌落純培養(yǎng) 對純培養(yǎng)物制片鏡檢 有條件的話查出菌的種屬類別 將純培養(yǎng)接種到無菌試管內保藏 1 4 1土樣采集土樣的采集選擇富含纖維素的環(huán)境 這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境 通