化學(xué)發(fā)光技術(shù)綜述模板

化學(xué)發(fā)光技術(shù)綜述化學(xué)發(fā)光免疫測定（CLIA）是將抗原與抗體特異性反應(yīng)與敏感性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。（一）原理化學(xué)發(fā)光免疫測定（CLIA）屬于標(biāo)記抗體技術(shù)的一種，它以化學(xué)發(fā)光劑、催化發(fā)光酶或產(chǎn)物間接參與發(fā)光反應(yīng)的物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，當(dāng)標(biāo)記抗體或標(biāo)記抗原與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，發(fā)光底物受發(fā)光劑、催化酶或參與產(chǎn)物作用，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)中釋放可見光或者該反應(yīng)激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)光，最后用發(fā)光光度計(jì)進(jìn)行檢測。（二）特點(diǎn)特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化。（三）分類1、從反應(yīng)原理上，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)主要分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促反應(yīng)化學(xué)發(fā)光。1.1直接化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。直接化學(xué)發(fā)光速度快、試劑穩(wěn)定性好，但靈敏度略低于酶促發(fā)光。代表性的發(fā)光劑有：吖啶酯、三聯(lián)吡啶釕。1.1.1 吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。這類化合物的發(fā)光為閃光型，加入發(fā)光啟動(dòng)試劑后0. 4s 左右發(fā)射光強(qiáng)度達(dá)到最大，半衰期為0.9s左右。特點(diǎn)：發(fā)光反應(yīng)中在形成電子激發(fā)態(tài)中間體之前，聯(lián)結(jié)于吖啶環(huán)上的不發(fā)光的取代基部分從吖啶環(huán)上脫離開來，即未發(fā)光部分與發(fā)光部分分離，因而其發(fā)光效率基本不受取代基結(jié)構(gòu)的影響。吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物化學(xué)發(fā)光不需要催化劑，在有H2O2 的稀堿性溶液中即能發(fā)光。因此應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測具有許多優(yōu)越性。優(yōu)點(diǎn)主要有：背景發(fā)光低，信噪比高；發(fā)光反應(yīng)干擾因素少；光釋放快速集中、發(fā)光效率高、發(fā)光強(qiáng)度大；易于與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少；標(biāo)記物穩(wěn)定（在2-8 下可保存數(shù)月之久）。1.1.2.三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。1.2 酶促反應(yīng)化學(xué)發(fā)光是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑 稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。酶促化學(xué)發(fā)光靈敏度高，但速度慢，酶活性容易受外界影響，其代表性的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾及其衍生物、AMPPD1.2.1. 魯米諾及其衍生物（HRP)激活酶為辣根過氧化物酶（HRP)，魯米諾體系的發(fā)光基本上為閃光型且信號(hào)弱。但在使用增強(qiáng)劑的情況下，發(fā)光的持續(xù)時(shí)間可延到30-60min，發(fā)光強(qiáng)度至少增加100倍以上?，F(xiàn)通常采用的體系是Luminol/H2O2/HRP體系，即用HRP標(biāo)記抗原或抗體，以魯米諾或異魯米諾及其衍生物作發(fā)光底物，對碘苯酚或?qū)Ρ交拥茸髟鰪?qiáng)劑，用NaOH+H2O2作發(fā)光啟動(dòng)試劑，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)2min后，光反射強(qiáng)度達(dá)到最高峰；20min后，光強(qiáng)度減少20%。1.2.2. 異魯米諾（ABEI）新產(chǎn)業(yè)的化學(xué)發(fā)光使用的發(fā)光劑，使用的是閃光非酶激活技術(shù)，加入啟動(dòng)液后測試0.1-3s時(shí)間內(nèi)的發(fā)光強(qiáng)度。1.2.3 AMPPD (AP)激活酶為堿性磷酸酶（AP）AMPPD的特性：(1) 在堿性環(huán)境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；(2) 熱穩(wěn)定性好，在pH=7.0的水中，30時(shí)的分解半衰期為142h；(3) 發(fā)光為輝光型，波長為470nm，在15min時(shí)強(qiáng)度達(dá)到高峰，15-60min內(nèi)光信號(hào)強(qiáng)度維持一致，變化很小，即使在12h后仍能測定得出正確結(jié)果；(4) 加入增強(qiáng)劑如聚氯芐乙烯芐基二甲基銨(BDMQ)或BSA等，能明顯增強(qiáng)AP酶解AMPPD的發(fā)光強(qiáng)度，增強(qiáng)因素達(dá)100-倍?，F(xiàn)通常采用的體系是Dioxetane/AP/Enhance System，即用堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記抗原或抗體，用(金鋼烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作發(fā)光底物，在發(fā)光底物中加入增強(qiáng)劑。使用此系統(tǒng)的有美國DPC公司的Immulite System和Beckman Coulter公司Automated Immunoassay System等，邁瑞的化學(xué)發(fā)光所使用的底物基本上屬于AMPPD。2、從固相載體上，一般分為板式分離和磁珠分離2.1 板式分離技術(shù)：將抗原/抗體包被在微孔板上，反應(yīng)時(shí)，待檢物質(zhì)通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合于包被板上，通過洗滌液數(shù)次洗滌，實(shí)現(xiàn)結(jié)合部分和未結(jié)合部分的分離，后加入底物、啟動(dòng)試劑，用光電倍增管檢測發(fā)出的光信號(hào)。此分離技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）一致,只是將最后的顯色劑改為發(fā)光劑得以實(shí)現(xiàn)，多數(shù)手工法檢測，及部分半自動(dòng)儀器使用這種分離技術(shù)，由于抗原抗體結(jié)合在反應(yīng)孔中，反應(yīng)面積有限，所以為達(dá)到充分反應(yīng)，孵育時(shí)間一般比較長。常為0.5h2h。手工法化學(xué)發(fā)光最常用的發(fā)光體系是魯米諾/H2O2/增強(qiáng)劑，規(guī)格和ELISA基本一致，為48T/96T。2.2 磁珠分離技術(shù)超順磁珠是一種表面帶有特定活性基團(tuán)、大小均勻、 球形、具有超順磁性及保護(hù)殼的微粒。超順磁珠在有外磁場存在時(shí)表現(xiàn)出磁力而發(fā)生聚集，無磁場時(shí)又失去磁力而分散開來。通過一定的方法可將抗原/抗體等活性物質(zhì)和磁珠表面的活性基團(tuán)結(jié)合而包被于磁珠上面，檢測時(shí)，將待檢物和包被有抗原/抗體的磁珠在一定條件下孵育，通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合，后通過增加外部磁場，磁珠產(chǎn)生磁性而聚集在一起，即可進(jìn)行洗滌，實(shí)現(xiàn)結(jié)合部分和未結(jié)合部分的分離，最后加入底物、啟動(dòng)試劑，用光電倍增管檢測發(fā)出的光信號(hào)。使用磁珠法分離，由于反應(yīng)時(shí)磁珠均勻分布于整個(gè)液體中，反應(yīng)面積較大，更容易充分反應(yīng)，故孵育的時(shí)間較短。（四）一些自動(dòng)化儀器使用的方法原理：項(xiàng)目LIAISONByk-Sangtec)Axsym(雅培）Acess（貝克曼）Im