膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用ppt課件.ppt

膜片鉗技術(shù) 細胞生物學(xué)樊國達學(xué)號 2014年12月23日 2020 4 15 1 膜片鉗技術(shù) 向細胞內(nèi)注射恒定或變化的電流刺激 紀錄由此引起的膜電位的變化 這叫做電流鉗技術(shù) 在具體實驗中 可通過給予細胞一系列電流脈沖刺激 誘發(fā)細胞產(chǎn)生動作電位 2020 4 15 2 電壓鉗技術(shù)是通過向細胞內(nèi)注射一定的電流 抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流 從而將細胞膜電位固定在某一數(shù)值 由于注射電流的大小與離子流的大小相等 方向相反 因此它可以反映離子流的大小和方向 2020 4 15 3 膜片鉗技術(shù) 膜片鉗技術(shù)與電流鉗 電壓鉗技術(shù)在命名上并不完全一致 后兩者是從電學(xué)概念的角度命名的 而 膜片鉗 主要是從機械物理學(xué)的角度命名的 2020 4 15 4 膜片鉗技術(shù) 從字面上理解 膜片鉗技術(shù)鉗制的是 膜片 是指采用尖端經(jīng)處理的微電極與細胞膜發(fā)生緊密接觸 使尖端下的這片細胞膜在電學(xué)上與其他細胞膜分離 這大大降低了背景噪聲 使單通道微弱的電流得以分辨出來 2020 4 15 5 膜片鉗技術(shù) 所以 膜片鉗技術(shù)是一種通過微電極與細胞膜之間形成緊密接觸的方法 采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對生物膜上的離子通道的電活動進行記錄的微電極技術(shù) 膜片鉗技術(shù)是一種特殊的電壓鉗 電流鉗技術(shù) 2020 4 15 6 膜片鉗技術(shù) 用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面 使之形成10 100G 的密封 被孤立的小膜片面積為 m2量級 內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道 然后對該膜片實行電壓鉗位 可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流 這種通道開放是一種隨機過程 通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化 可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布 并分析膜電位與離子濃度等之間的關(guān)系 2020 4 15 7 膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別 但其基本組成是相同的 包括膜片鉗放大器和接口 顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等 2020 4 15 8 倒置顯微鏡 防震臺 屏蔽罩 三維操縱儀 三維操縱儀 倒置顯微鏡 2020 4 15 9 膜片鉗放大器 2020 4 15 10 膜片鉗實驗流程 膜片鉗實驗方法包括 制備玻璃微電極 制備細胞標(biāo)本 建立高阻封接 電流記錄 2020 4 15 11 制備玻璃微電極 拉制微電極材料 硼硅酸鹽毛細玻璃管 要求 玻璃毛胚外徑1 3 1 7 內(nèi)徑1 0 1 2 壁的厚度在0 2 以上 管壁越厚 拉制出的電極尖端管壁也越厚 電極的跨壁電容就越小 噪聲也就越低 2020 4 15 12 玻璃微電極及膜片的幾何形狀 2020 4 15 13 電極拉制儀 2020 4 15 14 拉制方法 兩步拉制法 第一步 使玻璃軟化 并拉開一個距離 形成一個細管 即拉制電極的頸部 第二步 使用較低的熱度 拉斷細管部 成為兩個基本相同的玻璃微電極 此步控制電極的尖端 一般拉制出的玻璃微電極尖端直徑為1 5 m 2020 4 15 15 涂膠和拋光 對玻璃微電極進行涂膠和拋光 涂膠 疏水性涂料 如硅酮樹脂 主要是為了減小電極的跨壁電容 2020 4 15 16 拋光儀 拋光是指將玻璃微電極靠近加熱的鉑絲 從而使電極尖端變光滑的過程 拋光主要目的是 防止電極尖端刺破細胞 利于高阻封接 2020 4 15 17 電極液的充灌 對于尖端較細的玻璃微電極 膜片鉗實驗中常用的方法是 在微電極尾部施加負壓使尖端充灌電極內(nèi)液 然后用注射器在微電極尾部充灌電極內(nèi)液 最后輕彈微電極桿步使其內(nèi)的氣泡排出 充灌長度為電極的1 3 2020 4 15 18 制備細胞標(biāo)本 從理論上來講 膜片鉗實驗用的細胞標(biāo)本可來自體內(nèi)各種組織細胞 只要細胞表面光滑 能與微電極尖端形成高阻封接即可 但在標(biāo)本制備上 不同組織細胞間聯(lián)接牢固程度不同 采用的分離方法也不完全相同 大體上包括沖洗 酶解消化或機械分離以及清洗等步驟 2020 4 15 19 建立高阻封接 在顯微鏡下找到微電極 移動三維操縱儀 使電極尖端接觸細胞 形成高阻封接 2020 4 15 20 建立高阻封接 高阻封接形成是進行膜片鉗實驗的關(guān)鍵一步 微電極尖端與細胞膜形成封接的過程 可以采用軟件發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極 造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化 產(chǎn)生電極電流 再通過顯示屏 觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度 在電極未入溶液之前 在顯示器上可見一直線 2020 4 15 21 高阻封接形成的電流圖 2020 4 15 22 膜片鉗技術(shù)四種基本記錄模式 細胞吸附膜片 cell attachedpatch 將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上 形成高阻封接 在細胞膜表面隔離出一小片膜 既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制 高分辨測量膜電流 稱為細胞貼附膜片 由于不破壞細胞的完整性 2020 4 15 23 全細胞記錄法 Whole cellrecording 在高阻抗封接做好后 再給一個很小的負壓 將電極覆蓋的膜吸破 使電極內(nèi)與整個細胞內(nèi)相通 用這個方法可記錄進出整個細胞的電流 2020 4 15 24 內(nèi)面向外膜片 inside outpatch 高阻封接形成后 在將微管電極輕輕提起 使其與細胞分離 電極端形成密封小泡 在空氣中短暫暴露幾秒鐘后 小泡破裂再回到溶液中就得到 內(nèi)面向外 膜片 2020 4 15 25 外面向外膜片 Outside outpatch 在全胞記錄式的基礎(chǔ)上 拉開電極使之與胞體脫離 這是附在電極尖端的膜片又可自動地將電極尖端口封住 此膜片的外側(cè)面向外其是在全細胞記錄的基礎(chǔ)上改進而成 2020 4 15 26 膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用 2008年 第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物物理研究所的研究人員采用膜片鉗和激光掃描共聚焦顯微鏡 同步實時系統(tǒng)觀察心肌細胞鈣離子的釋放 2020 4 15 27 基本原理 膜片鉗能獲得膜上鈣離子通道的離子電流 但不能對離子的移動進行實時定位 不能定量分析離子濃度 激光掃描共聚焦顯微鏡可以對鈣離子的移動進行實時定位 但無法對單個離子通道的離子移動信號 如單通道電流 進行分析 2020 4 15 28 大鼠心室肌細胞L2型鈣通道電流 ICa L 2020 4 15