全內(nèi)反射熒光成像基本原理

全內(nèi)反射熒光成像基本原理TotalInternalReflectionFluorescence TIRF 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 TIRFM 目前用于單分子研究的檢測(cè)技術(shù)主要有兩大類 掃描探針顯微技術(shù) SPM 和光學(xué)技術(shù) 其中 SPM 原子力顯微技術(shù) AFM 掃描離子電導(dǎo)顯微技術(shù) SICM 掃描隧道顯微技術(shù) STM 上世紀(jì)80年代 Axelrod等生物物理學(xué)家對(duì)TIRFM技術(shù)及基本原理進(jìn)行描述 并探索了其在生物方面的應(yīng)用 發(fā)展歷程 Axelrod Julius 阿克塞爾羅德 Axelrod Julius 美國(guó)生物化學(xué)家及藥理學(xué)家 1970年他與卡茨馮奧伊勒共享了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 于美國(guó)衛(wèi)生研究院度過(guò)其大部職業(yè)生涯 他研究藥物及激素的作用 神經(jīng)沖動(dòng)傳播的化學(xué)方面 并特別研究松果體的功能 光反射和折射示意圖 全內(nèi)反射示意圖 光的反射和折射 Snell定律 當(dāng)入射角不斷增大 透射角為增大90 時(shí) 入射角達(dá)到臨界角 c 依據(jù)Snell定律得出 當(dāng)入射角繼續(xù)增大時(shí) 光不再透射進(jìn)水溶液 即發(fā)生了全內(nèi)反射 實(shí)際上 由于光的波動(dòng)效應(yīng) 有一部分光的能量會(huì)透過(guò)臨界面滲透到水溶液中 平行于界面向水溶液中傳播 這一部分透過(guò)的能量場(chǎng)則稱之為 隱失波 或 隱失場(chǎng) 隱失波 隱失波 隱失波的頻率與入射光線的頻率相同 其強(qiáng)度隨臨界面的垂直距離呈指數(shù)衰減 其中 Z是離開(kāi)分界面的距離 I z 表示距離界面Z處的強(qiáng)度 I 0 表示臨界面處的強(qiáng)度 由于隱失波僅在界面上極薄的一層范圍內(nèi)傳播 所以利用隱失波照明樣品 可以僅激發(fā)厚度大約100nm內(nèi)的熒光團(tuán) 而更深層溶液中的熒光基團(tuán)不會(huì)被激發(fā) 因此極大地提高了顯微成像的對(duì)比度和信噪比 d12是滲透深度 它等于從分界面處到光強(qiáng)衰減l e處的距離 隱失波的滲透深度d12是入射角及相對(duì)折射率的函數(shù) d12是滲透深度 它等于從分界面處到光強(qiáng)衰減到分界面處數(shù)值l e的處的距離 對(duì)于可見(jiàn)光波長(zhǎng)而言 浸透深度約為100nm 隱失波強(qiáng)度成指數(shù)衰減曲線 隱失波存在的實(shí)驗(yàn)證明 兩塊光密媒質(zhì)做的棱鏡中間夾一薄層空氣層 光疏媒質(zhì) 如果不斷減少空氣層的厚度 由于空氣層中有透射波 這透射波進(jìn)人第二塊棱鏡 光學(xué)隧道效應(yīng) 光強(qiáng)度并不發(fā)生全反射 而是有隱失波存于介質(zhì)2中 當(dāng)光疏介質(zhì)薄膜的厚度小于隱失波的滲透深度時(shí) 這個(gè)波不僅穿過(guò)了光疏介質(zhì) 而且會(huì)促進(jìn)鄰近高折射率介質(zhì)3中的電子作受迫振動(dòng) 由此產(chǎn)生了新的次波 隱失波的形態(tài)發(fā)生了顯著改變 全反射被破壞 能量發(fā)生了流動(dòng) 導(dǎo)致了光學(xué)隧道效應(yīng)的產(chǎn)生 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 是利用光發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)產(chǎn)生的隱失波照明樣本 僅激發(fā)樣本表面薄層范圍內(nèi)的熒光基團(tuán) 與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比 使顯微成像在Z軸上的空間分辨率得到了顯著改善 大大提高了圖像的信噪比和對(duì)比度 全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng) 分子熒光的產(chǎn)生 當(dāng)一束特定波長(zhǎng)的光照射到物質(zhì)時(shí) 物質(zhì)分子與光量子發(fā)生 碰撞 如果這次碰撞時(shí)有效的 激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短 返回速度快的途徑發(fā)生的幾率大 熒光 10 7 10 9s磷光 10 4 100s 分子熒光的產(chǎn)生 電子躍遷的單重態(tài) 單線態(tài) 與三重態(tài) 三線態(tài) 在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過(guò)程中 分子中的價(jià)電子 n 處于不同的自旋狀態(tài) 通常用多重態(tài)M來(lái)描述 M 2S 1 1電子自旋的大小用自旋量子數(shù)S表示 S可為 1 2或 1 2 這里的正負(fù)號(hào)取決于自旋的方向 基態(tài)中每個(gè)能級(jí)通常被兩個(gè)自旋相反的即自旋配對(duì)的電子占據(jù) M 1 成為單重態(tài) 當(dāng)成對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到S1 S2等電子能級(jí)激發(fā)態(tài)時(shí) 其自旋不變 即仍和處于基態(tài)的另一電子成對(duì) 這些能態(tài)都被稱為單線態(tài)或單重態(tài) singletstate 但如果處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子通過(guò)無(wú)輻射躍遷 系間跨越 intersystemcrossing 改變自旋方向 則因消耗部分能量而降至另一種激發(fā)態(tài) S 1 2 1 2 1 多重度M 2S 1 2 1 1 3 這種電子激發(fā)態(tài)稱為三重態(tài) tripletstate 分子熒光的產(chǎn)生 雅布隆斯基分子能級(jí)圖 熒光發(fā)射 電子由第一激單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)到基態(tài) 多為S1 S0 由于基態(tài)中也有振動(dòng)弛豫躍遷 這使得發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量要小 所以 熒光的特征波長(zhǎng)比入射波長(zhǎng)要長(zhǎng) 熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷 產(chǎn)生速度快 10 9 10 7s 又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光 外部光源停止照射 熒光馬上會(huì)消失 磷光發(fā)射 第一激發(fā)三重最低振動(dòng)能級(jí)到基態(tài) 10 4 10s 外部光源停止照射后 可以持續(xù)一段時(shí)間 分子熒光的產(chǎn)生 目前 大多數(shù)全內(nèi)反射熒光顯微鏡主要有兩種基本類型 棱鏡型和物鏡型 或無(wú)棱鏡型 棱鏡型 全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu) 全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu) 物鏡型使用高數(shù)值孔徑 NA 1 4 的物鏡作為熒光信號(hào)的接受器 同時(shí)又作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件 樣品的放置非常方便 并且可與多種技術(shù)聯(lián)用 例如納米操縱 光鑷技術(shù) 原子力顯微鏡等 該系統(tǒng)的關(guān)鍵是高數(shù)值孔徑物鏡的使用 由于細(xì)胞的典型折射率為1 33 1 38 因此要實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射 物鏡的NA必須大于1 38 表達(dá)式為 NA nsi