第二章-天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術.ppt

第二章天然藥物化學成分提取分離和鑒定的方法與技術 佛山科學技術學院李海燕 本章內容 第一節(jié)提取的方法與技術第二節(jié)分離精制和鑒定的方法與技術 3 27 第一節(jié)提取的方法與技術 章目錄 一 溶劑提取法 1 概念溶劑提取法是指根據(jù)天然藥物中各種化學成分的溶解性能 選擇對有效成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑 用適當?shù)姆椒▽⑺杌瘜W成分盡可能完全地從藥材組織中溶解提出的方法 章目錄 一 溶劑提取法 2 基本原理溶劑提取法是在滲透 擴散作用下 溶劑滲入藥材組織細胞內部 溶解可溶性物質 造成細胞內外溶質的濃度差 從而帶動溶質作不斷往返的運動 直至細胞內外溶液中被溶解的化學成分的濃度達到平衡 提出所需化學成分 章目錄 選擇合適的溶劑是溶劑提取法的關鍵 常用溶劑的極性大小順序排列如下 石油醚 苯 無水乙醚 三氯甲烷 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 水 親脂性有機溶劑 親水性有機溶劑 良好溶劑的選擇應遵循 相似相溶 的規(guī)律 根據(jù)溶劑的極性 被提取成分及共存的其他成分的性質來決定 同時兼顧考慮溶劑是否使用安全 易得 價廉 濃縮方便等問題 一 溶劑提取法 章目錄 方法與技術 一 浸漬法 二 滲漉法 三 煎煮法 四 回流提取法 五 連續(xù)回流提取法 六 超聲提取法 一 溶劑提取法 章目錄 一 浸漬法 是將藥材用適當?shù)娜軇┰诔鼗驕責岬臈l件下浸泡一定時間 浸出有效成分的一種方法 操作技術 一 溶劑提取法 冷浸法 溫浸法 章目錄 二 滲漉法 是將藥材粗粉置滲漉裝置中 連續(xù)添加溶劑使?jié)B過藥粉 自上而下流動 浸出有效成分的一種動態(tài)浸提方法 操作技術 粉碎浸潤裝筒排氣浸漬滲漉收集滲漉液 一 溶劑提取法 章目錄 三 煎煮法 是將藥材加水加熱煮沸 濾過去渣后取煎煮液的一種傳統(tǒng)提取方法 操作技術 取藥材飲片或粗粉 置適當煎器 勿使用鐵器 中 加水浸沒藥材 加熱煮沸 保持微沸 煎煮一定時間后 分離煎煮液 藥渣可繼續(xù)依法煎煮數(shù)次 合并各次煎煮液 濃縮即得 一 溶劑提取法 章目錄 四 回流提取法 使用低沸點有機溶劑如乙醇 三氯甲烷等加熱提取天然藥物中有效成分時 為減少溶劑的揮發(fā)損失 保持溶劑與藥材持久的接觸 通過加熱浸出液 使溶劑受熱蒸發(fā) 經冷凝后變?yōu)橐后w流回浸出器 如此反復至浸出完全的一種熱提取方法 一 溶劑提取法 章目錄 四 回流提取法 操作技術 將藥材粗粉裝入圓底燒瓶內 添加溶劑至蓋過藥面 一般至燒瓶容積1 2 2 3處 接上冷凝管 通入冷卻水 于水浴中加熱回流一定時間 濾出提取液 藥渣再添加新溶劑回流2 3次 合并濾液 回收有機溶劑后得濃縮提取液 一 溶劑提取法 章目錄 五 連續(xù)回流提取法 是在回流提取法的基礎上改進的 能用少量溶劑進行連續(xù)循環(huán)回流提取 充分將有效成分浸出完全的方法 一 溶劑提取法 章目錄 操作技術先在圓底燒瓶內放入幾粒沸石 然后將裝好藥材粉末的濾紙袋或筒放入提取器中 藥粉高度應低于虹吸管頂部 自冷凝管加溶劑入燒瓶內 水浴加熱 至有效成分充分被浸出 提取液回收有機溶劑即得 五 連續(xù)回流提取法 一 溶劑提取法 章目錄 六 超聲提取法 是一種利用超聲波浸提有效成分的方法 其基本原理是利用超聲波的空化作用 破壞植物藥材的細胞 使溶劑易于滲入細胞內 同時超聲波的強烈振動能傳遞巨大能量給浸提的藥材和溶劑 使它們作高速運動 加強了胞內物質的釋放 擴散和溶解 加速有效成分的浸出 極大地提高提取效率 一 溶劑提取法 章目錄 六 超聲提取法 操作技術 將藥材粉末置適宜容器內 加入定量溶劑 密閉后置超聲提取器內 選擇適當超聲頻率提取一段時間 一般只需要數(shù)十分鐘 后即得 一 溶劑提取法 章目錄 二 其他提取方法 一 水蒸氣蒸餾法 是一種利用某些揮發(fā)性成分與水或水蒸氣共同加熱 能隨水蒸氣一并蒸餾出 經冷凝后分取獲得的性質 使之從天然藥物中提出的方法 章目錄 一 水蒸氣蒸餾法 操作技術 將藥材粗粉裝入蒸餾瓶內 加入水使藥材充分浸潤 體積不超過蒸餾瓶容積的1 3 然后加熱水蒸氣發(fā)生器使水沸騰 產生水蒸氣通入蒸餾瓶 藥材中揮發(fā)性成分隨水蒸氣蒸餾被帶出 經冷凝后 收集于接受瓶中 若餾出液由渾濁變澄清透明 表示蒸餾基本完成 二 其他提取方法 章目錄 二 升華法 是利用某些固體物質具有在低于其熔點的溫度下受熱后 不經熔融就直接轉化為蒸氣 遇冷后又凝固為原來的固體的性質 使之從天然藥物中提出的方法 二 其他提取方法 章目錄 二 升華法 操作技術 預先粉碎待升華的天然藥物 將粉末置于升華器皿中 鋪均勻 上面放一冷凝器 加熱升華器皿到一定溫度 使被提取物質升華 升華物質冷凝于冷凝器表面即得 二 其他提取方法 章目錄 三 超臨界流體萃取技術 超臨界流體萃取 supercriticalfluidextraction SFE 是一種利用某物質在超臨界區(qū)域形成的流體 對天然藥物中有效成分進行萃取分離的新型技術 集提取和分離于一體 二 其他提取方法 章目錄 三 超臨界流體萃取技術 操作技術 超臨界流體萃取工藝程序 將藥材原料投入萃取器6中 對萃取器6和分離器7分別進行加熱或冷卻 當達到所選定的溫度時 開啟CO2氣瓶閥門及閥門12進氣 啟動高壓閥4對系統(tǒng)加壓 當達到預定壓力時 調節(jié)減壓閥9 使分離器7內壓力達到設定值 打開放空閥10調節(jié)流量 通過各閥門的調節(jié) 使萃取過程中通過的流量及萃取器內壓力 分離器內壓力都穩(wěn)定在設定的操作條件后 關閉閥門10 打開閥門11 開始進行循環(huán)萃取 萃取過程中達到一定時間后 從閥門8取出萃取物 二 其他提取方法 章目錄 三 超臨界流體萃取技術 超臨界流體萃取工藝程序 1CO2氣瓶2純化器3冷凝器4高壓泵5加熱器6萃取器7分離器8放油器9減壓閥10 11 12閥門 二 其他提取方法 章目錄 課堂活動 如何根據(jù)實際工作的需要選擇適當?shù)奶崛》椒?試用連線一一對應連接 并敘述各法選用的儀器 操作步驟 注意事項和適用范圍 章目錄 浸漬法提取受熱易破壞的成分 能保持良好濃度差的一種動態(tài)浸提方法滲漉法以水為溶劑加熱提取煎煮法使用索氏提取器進行提取回流提取法提取受熱易破壞的成分及含多糖物質較多的天然藥物連續(xù)回流提取法用有機溶劑自天然藥物中提取脂溶性成分水蒸氣蒸餾法提取有升華性的成分升華法提取能隨水蒸氣蒸餾且不溶于水的成分 課堂活動 章目錄 點滴積累 1 天然藥物化學成分的提取方法有溶劑提取法 水蒸氣蒸餾法 升華法 超臨界流體萃取技術等 溶劑提取法是目前提取有效成分最常用的方法 具體的操作技術有浸漬法 滲漉法 煎煮法 回流提取法 連續(xù)回流提取法 超聲提取法等 2 研究天然藥物化學成分需首先從提取工作開始 對各種方法所用的溶劑種類 儀器 特點及適用范圍進行比較區(qū)別 合理設計提取方法和正確的提取操作將為下一步分離工作的順利進行打下堅實的基礎 章目錄 第二節(jié)分離精制和鑒定的方法與技術 章目錄 一 系統(tǒng)溶劑分離法 是一種按極性由小到大的順序選用不同極性的溶劑組成溶劑系統(tǒng) 依次提取分離提取液中各種不同成分 使各溶解度有差異的成分得到分離的方法 此法是早年研究天然產物有效成分的一種最主要的方法 目前仍是研究不明成分最為常用的方法 章目錄 操作技術 適當濃縮總提取液 或拌入適量惰性吸附劑如 粗硅膠 纖維粉及硅藻土等 低溫或自然干燥后粉碎 然后依次用石油醚 或苯 乙醚 三氯甲烷 乙酸乙酯 丙酮 乙醇和水分步進行抽提 使溶解度不同的各種成分得到分段分離 也可以選擇其中三 四種不同極性的溶劑組成溶劑系統(tǒng) 如石油醚 苯 乙醚 三氯甲烷 乙酸乙酯 正丁醇或戊醇 由低極性到高極性分步進行抽提 分成若干部位 一 系統(tǒng)溶劑分離法 章目錄 生物堿 強心苷 黃酮類 皂苷 生物堿鹽等 揮發(fā)油 蛋白質等 石油醚 苯 乙醚 三氯甲烷 三氯甲烷 乙醇 乙酸乙酯 正丁醇 甲醇 乙醇 丙酮 水 一 系統(tǒng)溶劑分離法 章目錄 二 兩相溶劑萃取法 是指往提取液中加入一種與其互不相溶的溶劑配成兩相溶劑系統(tǒng) 利用混合物中各種成分分配系數(shù)的差異而將所需成分萃取出來的分離方法 章目錄 基本原理 利用混合物中各種成分在兩相互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的差異而達到分離的目的 混合物中各種成分在同一兩相溶劑系統(tǒng)中分別有各自不同的分配系數(shù) 若各種成分的分配系數(shù)差異越大 則分離效果越好 K Cu CLK表示分配系數(shù) Cu表示溶質在上相溶劑中的濃度 CL表示溶質在下相溶劑中的濃度 二 兩相溶劑萃取法 章目錄 一 簡單萃取法 二 兩相溶劑萃取法 待萃取物和溶劑裝入分液漏斗 振搖 重復數(shù)次 靜置 使兩液分層 開啟活塞使下層液放出 從分液漏斗的上端倒出上層液 操作技術 這是一種常用的簡便萃取技術 小量萃取一般在分液漏斗中進行 章目錄 二 逆流連續(xù)萃取法是利用兩相互不相溶的溶劑相對密度的不同 使相對密度小的相液作為移動相 或分散相 逆流連續(xù)穿過相對密度大的作為固定相 或連續(xù)相 的相液 借以交換溶質而達到分離的一種連續(xù)萃取技術 二 兩相溶劑萃取法 章目錄 三 逆流分溶法逆流分溶法 countercurrentdistribution CCD 是一種高效 多次 連續(xù)的兩相溶劑萃取分離方法 亦稱為逆流分配法 逆流分布法或反流分布法 二 兩相溶劑萃取法 章目錄 四 液滴逆流分配法液滴逆流分配法 dropletcountercurrentchromatography DCCC 利用混合物中各成分在兩液相間的分配系數(shù)的差異 使移動相形成液滴 通過作為固定相的液柱實現(xiàn)逆流分配 從而達到分離目的 二 兩相溶劑萃取法 章目錄 三 沉淀法 是指在天然藥物的提取液中加入某些試劑 使產生成沉淀或降低溶解性而從溶液中析出 從而獲得有效成分或去除雜質的方法 章目錄 一 酸堿沉淀法是一種利用某些成分能在酸 或堿 中溶解 繼而又在堿 或酸 中生成沉淀的性質達到分離的方法 操作技術 往提取液中加入適量酸水 或堿水 將欲分離成分處理成鹽溶解于酸水 或堿水 中 然后再加入適量堿水 或酸水 使欲分離成分恢復原來的結構 形成沉淀析出 最后可以離心或利用與水不相混溶的有機溶劑把這些化學成分萃取分離獲得 三 沉淀法 章目錄 二 試劑沉淀法是一種利用一些成分能與某些試劑產生沉淀的性質 或利用某些成分在不同溶劑中溶解度的差異 通過加入特定試劑或溶劑 使生成沉淀 與其他成分分離的方法 操作技術 向提取液中加入某些特定試劑或溶劑 使欲分離成分與試劑生成沉淀或因溶解度降低而沉淀析出 待完全沉淀后 濾過即得 三 沉淀法 章目錄 四 結晶與重結晶法 是利用混合物中各種成分在溶劑中溶解度的差別 使所需成分以結晶狀態(tài)析出 再進一步純化處理 以達到分離精制目的的分離方法 章目錄 選擇合適的溶劑是結晶法的關鍵 理想的溶劑必須具備以下條件 不與結晶物質發(fā)生化學反應 對結晶物質的溶解度隨溫度不同有顯著差異 熱時溶解度大 冷時溶解度小 對可能存在的雜質溶解度非常大或非常小 即冷熱均溶或均不溶 沸點適中 不宜過高或過低 能給出較好的結晶 常用的溶劑有水 乙酸 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 三氯甲烷等 當不能選擇到一種合適的溶劑時 通常選用兩種或兩種以上溶劑組成的混合溶劑 四 結晶與重結晶法 章目錄 操作技術 四 結晶與重結晶法 章目錄 難點釋疑 結晶法如何選擇合適的混合溶劑 選用混合溶劑 最好選擇結晶成分能在低沸點溶劑中易溶解 而在高沸點溶劑中難溶解的兩種混合溶劑 因為低沸點溶劑較易揮發(fā)而逐漸減少在混合溶劑中的比例 結晶即可慢慢析出 章目錄 五 透析法 是利用透析膜具有選擇性透過的特點 使提取液中小分子物質可通過透析膜 而大分子物質不能通過 則分子量差異較大的物質獲得分離的方法 章目錄 操作技術 如圖所示 將提取液置透析膜中 扎緊口 外面護以尼龍網袋 放入清水缸中 不斷更換缸內的水 使膜內外的濃度差增加 或稍加攪拌或適當加溫處理 也可以在近透析膜兩旁處放置兩個電極 稱電透析 通電后使帶電荷離子的透析速度增加10倍以上 以加快透析的速度 透析過程中 用定性反應對膜內藥液有效成分或指標成分進行檢查分析 判斷透析是否完全 五 透析法 章目錄 六 分餾法 是利用各沸點不同的化合物組成的混合物 在分餾過程中產生高低不同的蒸氣壓 從而收集到不同沸點溫度的餾分 達到分離目的的方法 章目錄 操作技術 實驗室常用簡單分餾裝置如圖所示 操作時將待分餾的試樣放入圓底燒瓶中 加入沸石 安裝好裝置后 在分餾柱的外圍盡量用石棉繩包住 選擇合適的熱浴加熱 當瓶內液體一開始沸騰時 就要注意調節(jié)溫度 使蒸氣緩慢升入分餾柱 當蒸氣進入分流柱時 由于柱外空氣的冷卻 部分蒸氣凝成液體 顯然高沸點的組分較易被冷凝 隨著分流柱管的升高 愈向上混合蒸氣中所含高沸點的組分愈少 到了一定高度時可獲得某一純的組分 待低沸點組分蒸完后 再逐漸升溫 如此進行操作 使不同沸點的組分逐一分餾出來 六 分餾法 章目錄 課堂活動 天然藥物提取液為混合物 根據(jù)成分性質的不同 請用連線選擇相適應的分離方法 系統(tǒng)溶劑萃取法從某天然藥物的水提液中加入戊醇獲取皂苷兩相溶劑萃取法分離未知成分的天然藥物提取液沉淀法去除鹽酸小檗堿粗制品中的雜質 已知鹽酸小檗堿熱水易溶 冷水難溶 結晶法加入雷氏銨鹽從某天然藥物水提液中獲得季銨鹽透析法毒芹總堿中的毒芹堿 沸點166 167 和羥基毒芹堿 沸點226 分餾法分離某天然藥物蛋白質提取液中的無機鹽和其他小分子雜質 章目錄 七 色譜法 色譜法 chromatography 又稱為色譜分離法 層析法 是一種分離 純化和鑒定化合物的物理化學分離分析方法 基本原理 是利用混合物中各成分在固定相和移動相中吸附 分配及其親和力的差異而達到分離 章目錄 色譜法的分類 七 色譜法 章目錄 被分離化合物與相應選擇的色譜方法 七 色譜法 章目錄 一 柱色譜法是一種將分離材料裝入柱狀容器中 以適當?shù)南疵搫┻M行洗脫而使不同成分得到分離的色譜分離方法 也是色譜法最早出現(xiàn)的形式 可用于分離天然藥物中各種化學成分 1 吸附柱色譜法是一種在柱狀容器中操作 利用作為固定相的吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的大小不同 使各成分得到相互分離的方法 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 1 基本原理 當混合物成分到達作為固定相的吸附劑表面時 由于吸附劑表面與成分分子的吸附作用 產生了成分分子在吸附劑表面濃度增大的吸附現(xiàn)象 當移動相連續(xù)通過吸附劑表面時 由于移動相與混合物成分爭奪吸附劑活性表面 產生了成分分子溶解于移動相的解吸附現(xiàn)象 隨著移動相的移動 混合物在不斷進行著吸附 解吸附的可逆過程 利用各成分在兩相中遷移速度的不同而達到分離 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 2 常用的吸附劑 吸附劑有氧化鋁 硅膠 硅藻土 氧化鎂 碳酸鈣 聚酰胺和活性炭等 常用的有以下幾種 1 硅膠2 氧化鋁3 聚酰胺4 活性炭 七 色譜法 章目錄 1 硅膠硅膠是一種微呈酸性的多孔性物質 常用SiO2 xH2O表示 為硅氧烷交鏈結構 其骨架表面具有很多硅醇基 使硅膠能與許多化合物形成氫鍵而產生吸附作用 游離硅醇基數(shù)目的多少決定了硅膠吸附作用的強弱 硅醇基也容易通過氫鍵與水結合 隨著含水量的增加 硅膠表面的游離硅醇基數(shù)目減少 硅膠吸附其他化合物的能力便隨之減弱 七 色譜法 章目錄 2 氧化鋁氧化鋁是一種吸附力很強的親水性吸附劑 有酸性 堿性 中性三種規(guī)格 其吸附活性也與含水量有關 隨著含水量的增加 吸附能力減弱 七 色譜法 章目錄 硅膠 氧化鋁活度與含水量關系 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子化合物 商品名又稱為綿綸 尼龍 色譜分離常用聚己內酰胺 綿綸6 和聚己二酰己二胺 綿綸66 其中聚己內酰胺可用結構式表示為 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺 移動相 聚酰胺吸附色譜的原理 固定相 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺 聚酰胺對化合物吸附力的強弱取決于形成氫鍵的能力 形成氫鍵的能力受以下因素影響 溶劑的種類 聚酰胺形成氫鍵的能力在水中最強 在有機溶劑中較弱 在堿性溶劑中最弱 若應用各種溶劑在聚酰胺柱色譜中作為洗脫劑 則洗脫能力的順序如下 水 甲醇或乙醇 丙酮 稀氫氧化鈉液或稀氨溶液 甲酰胺或二甲基甲酰胺 尿素水溶液 化合物分子結構 在含水溶劑中 化合物分子結構對氫鍵締合的影響有以下幾點規(guī)律 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺 A 化合物分子中能形成氫鍵的基團數(shù)目越多 被聚酰胺吸附越強 如 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺 B 形成氫鍵的基團所處位置不同 被吸附的強度也不同 如 C 分子中芳香核 共軛雙鍵多者被吸附強度大 少者則被吸附強度小 如 七 色譜法 章目錄 3 聚酰胺 D 能形成分子內氫鍵者被吸附強度減小 如 七 色譜法 章目錄 4 活性炭 活性炭是一種非極性吸附劑 具有較強的吸附能力 其吸附能力受溶劑的影響 在水溶液中的吸附力最強 在有機溶劑中吸附力較弱 在一定條件下 對不同物質的吸附力也有差別 一般對極性基團多的化合物的吸附力大于極性基團少的化合物 對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物 對分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 3 移動相 用吸附柱色譜法分離混合物 選擇何種溶劑為移動相對分離效果有極大的影響 所選移動相溶劑應具備純度高 不含水分 與試樣 吸附劑不起化學反應 對被分離成分有適當?shù)娜芙舛?黏度小 易揮散等條件 對于極性吸附劑 若選擇的移動相溶劑極性越大 則其展開或洗脫能力就越強 對于非極性吸附劑 則剛好相反 選擇的移動相溶劑極性越小 其展開或洗脫能力就越強 具體選擇時 尚需結合被分離物質的極性來綜合考慮 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 4 被分離物質 被分離成分 吸附劑 移動相三者為組成吸附柱色譜必不可少的要素 被分離成分的結構和極性大小決定了其與吸附劑 移動相之間的相互作用 對于極性吸附劑 被分離物質的極性越大 被吸附越強 移動相進行洗脫就越困難 化合物的極性與其官能團的種類 數(shù)目及位置有關 同時也應注意考慮分子中電效應 立體效應等因素的影響 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 4 被分離物質 常見一些化合物官能團的極性大小順序如下 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法被分離成分 吸附劑 移動相三者關系密不可分 一般而言 極性吸附劑如硅膠 氧化鋁等適用于分離親脂性成分 非極性吸附劑如活性炭適用于分離親水性成分 若被分離物質的極性較大 可選用活度較低的吸附劑 而移動相的極性較大 若被分離物質的極性較小 可選用活度較高的吸附劑 而移動相的極性較小 具體應用時 需全面考慮吸附劑 移動相及被分離成分三者間相互聯(lián)系又相互制約的關系 選擇合適的條件 使達到分離的目的 七 色譜法 章目錄 1 吸附柱色譜法 5 操作技術 選擇色譜柱裝柱上樣洗脫收集洗脫液 七 色譜法 章目錄 課堂活動 模擬實驗室硅膠柱色譜操作 取一色譜柱和適量硅膠 學生練習濕法裝柱 敘述操作步驟及操作過程中的注意事項 教師針對崗位工作 講解實際應用 章目錄 2 分配柱色譜法是一種在柱狀容器中操作 利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同 來達到分離的色譜分離方法 1 基本原理 分配柱色譜的基本原理與兩相逆流萃取法相同 兩相溶劑中的一相需作為固定相 常以某種惰性固體吸住該相溶劑 使之固定 這種吸著了固定相溶劑的固體物質稱為支持劑 也稱載體或擔體 另一相溶劑則作為移動相 進行分離時 將被分離的混合物配成試樣溶液加到固定相上 通過移動相的流動 使試樣中各成分在兩相之間的分配不同而獲得分離 七 色譜法 章目錄 2 分配柱色譜法分配柱色譜根據(jù)固定相與移動相的極性不同又可分為正相分配色譜和反相分配色譜 以極性大的溶劑 如水或親水性溶劑 為固定相 極性小的溶劑為移動相的分配色譜稱為正相分配色譜 固定相常用水或緩沖液 移動相則采用三氯甲烷 乙酸乙酯 丁醇等弱極性有機溶劑 而以極性小的溶劑 如三氯甲烷 石油醚等親脂性有機溶劑 為固定相 移動相溶劑卻極性較大的分配色譜則稱為反相分配色譜 固定相可選用石蠟油 移動相可選擇水或甲醇 七 色譜法 章目錄 2 分配柱色譜法 2 支持劑 在分配柱色譜中 作為支持劑的固體物質要求其本身無吸附作用 不溶于兩相溶劑中 不與被分離物質發(fā)生化學反應 但能吸著一定量的固定相 且移動相能自由通過卻不改變其組成 常用的有吸水硅膠 硅藻土 纖維素粉和濾紙等 七 色譜法 章目錄 2 分配柱色譜法 3 溶劑系統(tǒng) 分配色譜中的固定相和移動相是由二元或三元甚至三元以上溶劑按一定比例組成的復合兩相溶劑系統(tǒng) 選擇適當?shù)娜軇┫到y(tǒng) 可提高分離的效率 常用紙色譜摸索具體的分離條件 尋找合適的溶劑系統(tǒng) 4 被分離物質 一般在正相分配色譜中 因移動相極性較固定相極性小 故被分離物質中極性較小的成分隨移動相遷移速度較快 反之 在反相分配色譜中 被分離物質中極性較大的成分隨移動相遷移速度較快 七 色譜法 章目錄 難點釋疑 如何正確理解分配柱色譜法中固定相 移動相與被分離物質三者間的關系 對于正相分配色譜 常選用極性大的溶劑 如水 緩沖溶液或親水性溶劑等 為固定相 極性小的溶劑 如三氯甲烷 乙酸乙酯 丁醇等 為移動相 用于極性較大的化合物如生物堿 苷類 酚性物質 有機酸和糖類等的分離 被分離物質中極性較小的成分隨移動相遷移速度較快 對于反相分配色譜 常選用極性小的溶劑 如三氯甲烷 石油醚等親脂性有機溶劑等 為固定相 極性大的溶劑 如水或甲醇等 為移動相 用于極性較小的化合物的分離 被分離物質中極性較大的成分隨移動相遷移速度較快 章目錄 3 離子交換柱色譜法是一種利用離子交換樹脂上的功能基能在水溶液中與溶液的其他離子進行可逆性交換的性質 以離子交換樹脂作為固定相 使混合成分中離子型與非離子型物質 或具有不同解離度的離子化合物得到分離的一種色譜方法 七 色譜法 章目錄 3 離子交換柱色譜法 1 基本原理 離子交換樹脂是一類含有解離性功能基團的特殊高分子化合物 一般呈球狀或無定形粒狀 根據(jù)其所含解離性功能基團的不同 可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩類 在水溶液中 前者能通過 SO3H COOH或酚羥基中解離的H 與溶液中的陽離子進行可逆性交換 后者能通過伯 仲 叔 季銨基中解離的OH 與溶液中的陰離子進行可逆性交換 而其本身卻不溶于水 酸 堿和有機溶劑 若以R代表離子交換樹脂的母體 則其色譜分離的基本原理可表示為 陽離子交換樹脂RSO3 H Na Cl RSO3 Na H Cl 陰離子交換樹脂RN OH Na Cl RN Cl Na OH 七 色譜法 章目錄 3 離子交換柱色譜法 2 離子交換樹脂的選擇 具體選擇離子交換樹脂時 應綜合考慮被分離物質所帶電荷種類及其解離能力強弱 分子的大小與數(shù)量 3 操作技術 樹脂的預處理裝柱上樣洗脫再生 七 色譜法 章目錄 4 凝膠濾過柱色譜法凝膠濾過柱色譜法又稱為凝膠滲透柱色譜法 分子篩濾過柱色譜法及排阻柱色譜法等 是以凝膠作為固定相 選擇適當?shù)娜軇┻M行洗脫 使混合物中分子量大小不同的化合物得到分離的方法 七 色譜法 章目錄 4 凝膠濾過柱色譜法 1 基本原理 凝膠是具有多孔性網狀結構的高分子化合物 由于受凝膠顆粒中網孔半徑的限制 被分離試樣中比網孔小的化合物可自由進入凝膠顆粒內部 而比網孔大的化合物不能進入凝膠顆粒內部被排阻 只能通過凝膠顆粒外部的間隙 隨著移動相的流動 被分離試樣中各成分的移動速率不同 大分子化合物阻力較小 流速較快 先被洗脫 而小分子化合物阻力較大 滯留在凝膠顆粒內部時間長 流速較慢 則后被洗脫 使試樣中大小分子化合物獲得分離 七 色譜法 章目錄 4 凝膠濾過柱色譜法 七 色譜法 章目錄 4 凝膠濾過柱色譜法 2 凝膠的種類及性能 選擇合適的凝膠 是凝膠色譜法分離的關鍵 商品凝膠的種類很多 常用的有 1 葡聚糖凝膠 又稱為交聯(lián)葡聚糖 是由葡聚糖和甘油通過醚橋 OCH2CHOHCH2O 相交鏈而成的多孔性網狀結構物質 具有親水性 但不溶于水 稀酸 堿和鹽溶液 能在水中溶脹成膠粒 在pH3 10內穩(wěn)定 適用于分離水溶性成分如蛋白質 肽 氨基酸 糖及苷類等 應用最為廣泛 七 色譜法 章目錄 交聯(lián)葡聚糖的化學結構 七 色譜法 章目錄 2 葡聚糖凝膠 sephadex LH 20 葡聚糖凝膠LH 20分子中引入了親脂性基團 除了能在水中溶脹外 也能在許多有機溶劑如醇 甲酰胺 丙酮 三氯甲烷等溶劑中溶脹 在乙酸乙酯 甲苯中溶脹不多 并在pH 2的無氧化劑溶液中呈穩(wěn)定狀態(tài) 增大了應用范圍 不僅可用于分離水溶性化合物 還可用于分離一些難溶于水或具一定程度親脂性的化合物 如黃酮 蒽醌 香豆素等 此外 還有聚丙烯酰胺凝膠 在pH2 10內穩(wěn)定 使用情況與葡聚糖凝膠相似 瓊脂糖凝膠 適合于分離分子量在百萬以上的特大分子化合物 以及結合了不同離子交換基團的葡聚糖凝膠衍生物等 七 色譜法 章目錄 4 凝膠濾過柱色譜法 3 操作技術1 凝膠的選擇2 凝膠的浸泡溶脹3 裝柱4 加樣5 洗脫6 再生 七 色譜法 章目錄 5 大孔吸附柱色譜法是一種利用大孔吸附樹脂具有的吸附性能及分子篩作用 使分子量的大小及吸附力的強弱不同的混合物中各成分獲得分離的方法 1 基本原理 大孔吸附樹脂是一種化學結構與離子交換樹脂類似卻不含交換基團 具有大孔結構的有機高聚物吸附劑 一方面 大孔吸附樹脂通過范德華引力或形成氫鍵等分子間力吸附有機化合物 另一方面 其本身的多孔性網狀結構決定了具有篩選性分離的特點 由于大孔吸附樹脂具有吸附性能及分子篩作用的特點 故欲分離的各天然藥物化學成分根據(jù)其分子量的大小及吸附力的強弱 在選定的大孔吸附樹脂上經適宜的溶劑洗脫而獲得分離 七 色譜法 章目錄 5 大孔吸附柱色譜法 2 大孔吸附樹脂的類型及性能 大孔吸附樹脂多為白色球形顆粒 粒度通常為20 60目 根據(jù)聚合材料的不同 可分為非極性 中極性和極性三大類型 大孔吸附樹脂的理化性質穩(wěn)定 不溶于酸 堿及有機溶劑 對有機物有較好的選擇性 不受無機鹽類及強離子低分子化合物存在的影響 3 影響分離的因素1 樹脂本身的化學結構2 被分離成分的性質3 溶劑的影響 七 色譜法 章目錄 課堂活動 根據(jù)不同性質的化學成分 請用連線選擇與其相適應的色譜分離方法 氧化鋁吸附柱色譜法分子量大小不同的化合物的分離凝膠濾過柱色譜法堿性親脂性化合物的分離聚酰胺吸附柱色譜法黃酮類化合物的分離離子交換色譜法酸性親脂性化合物的分離硅膠吸附柱色譜法離子性化合物的分離 章目錄 二 薄層色譜法薄層色譜法 thinlayerchromatography TLC 是一種在平面載板上均勻涂布適宜的固定相形成一薄層 將欲分離的試樣于薄層板上點樣 隨著移動相溶劑的移行展開 混合物中各成分獲得分離的方法 1 基本原理 與柱色譜法的原理基本一致 常見吸附薄層色譜和分配薄層色譜兩種 七 色譜法 章目錄 二 薄層色譜法 2 常用吸附劑和支持劑 吸附薄層色譜常用的吸附劑為氧化鋁 硅膠 硅藻土 聚酰胺 纖維素等 3 展開劑的選擇 展開劑的選擇可根據(jù)被分離物質的溶解性 酸堿性 極性等性質及溶劑的極性 結合考慮所選吸附劑的吸附性能 選擇單一溶劑或混合溶劑 4 顯色的方法 常用紫外線照射法 噴霧顯色法和碘蒸氣顯色法三種 七 色譜法 章目錄 二 薄層色譜法 5 操作技術 1 制板2 薄層板的活化3 點樣4 展開5 顯色6 計算比移值 七 色譜法 章目錄 二 薄層色譜法 9 制備性薄層色譜 當需要分離微量混合物或天然化合物的降解產物時 則選擇制備性薄層色譜 經制備性薄層色譜分離 可獲得毫克量的純品 七 色譜法 章目錄 課堂活動 制備硅膠G CMC Na板 稱取8g硅膠G 加24ml濃度0 5 CMC Na水溶液 在乳缽中研磨均勻后 倒在一定大小的玻璃載板上 均勻涂鋪 厚度約0 25 0 5mm 手輕輕振動玻璃板至表面均勻平整 室溫放置晾干 用前活化 請學生回答下列問題 1 如何進行活化 2 應用此硅膠板進行某混合物的分離