肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制培訓(xùn)資料.doc

肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制 萬建國各級各類實(shí)驗(yàn)室職責(zé)：縣（區(qū)）級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室在省、地（市）參比實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)下，制定本縣（市）結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查的工作計(jì)劃。按照國家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系的要求，做好本實(shí)驗(yàn)室開展檢查項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控工作，承擔(dān)同級間實(shí)驗(yàn)室（縣級）第一復(fù)檢者盲法復(fù)檢工作，在所屬地（市）級實(shí)驗(yàn)室的組織下，開展痰涂片鏡檢盲法復(fù)檢。按國家統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序常規(guī)開展痰涂片鏡檢工作，根據(jù)實(shí)際情況有能力、具備條件的可以開展結(jié)核菌培養(yǎng)。接受上級實(shí)驗(yàn)室的督導(dǎo)、現(xiàn)場評估和定期培訓(xùn)。對轄區(qū)內(nèi)鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院查痰點(diǎn)的工作提供技術(shù)支持。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)在我國結(jié)核病防治工作中發(fā)揮著重要作用，它可以方便結(jié)核病可疑癥狀者就醫(yī)，增加病人發(fā)現(xiàn)。各地應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況設(shè)立鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)應(yīng)該按衛(wèi)生部要求開展工作，國家統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序開展痰涂片鏡檢工作，并按規(guī)定送痰涂片至縣級進(jìn)行復(fù)檢；接受上級實(shí)驗(yàn)室的培訓(xùn)、現(xiàn)場督導(dǎo)和技術(shù)指導(dǎo)。醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室在相應(yīng)級別臨床檢驗(yàn)中心和上級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)指導(dǎo)下，開展質(zhì)量有保證的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查工作，嚴(yán)格按照相關(guān)各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室相關(guān)活動，并接受結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。涂片鏡檢實(shí)驗(yàn)室基本要求：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有實(shí)驗(yàn)室分區(qū)（涂片染色區(qū)域和讀片鏡檢區(qū)域），布局應(yīng)該符合生物安全二級（BSL-2）的要求；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在靠近出口處設(shè)置洗手池；實(shí)驗(yàn)室的墻壁、天花板和地面應(yīng)平整、易清潔、不滲水、耐化學(xué)品和消毒劑的腐蝕，地面應(yīng)防滑；實(shí)驗(yàn)操作臺面應(yīng)能防水，耐腐蝕、耐熱；實(shí)驗(yàn)室中的廚柜和實(shí)驗(yàn)臺應(yīng)牢固，廚柜、實(shí)驗(yàn)臺彼此之間應(yīng)保持一定距離，以便于清潔；對于實(shí)驗(yàn)室中可開啟的窗戶，應(yīng)安裝紗窗；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免不必要的反光和強(qiáng)光；應(yīng)有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)備；在實(shí)驗(yàn)室門口處應(yīng)設(shè)掛衣裝置，個(gè)人便裝與實(shí)驗(yàn)室工作服分開放置；10、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該裝備開展痰涂片檢查所需要的儀器和設(shè)備。檢查對象及要求：痰涂片檢查 （一）痰盒推薦使用螺旋蓋、可密封、廣口的塑料盒收集痰標(biāo)本，參考規(guī)格：直徑4厘米，高度2厘米。醫(yī)務(wù)人員在容器上應(yīng)注明患者姓名、編號（門診序號或登記號）、檢查項(xiàng)目、痰標(biāo)本序號1、2、3（1當(dāng)日即時(shí)痰，2夜間痰，3次日晨痰），然后交給患者。（二）標(biāo)本采集1、時(shí)間根據(jù)痰標(biāo)本采集的時(shí)間，可將標(biāo)本分為三類：即時(shí)痰：就診時(shí)深呼吸后咳出的痰液；晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液；夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出的痰液；2、痰采集方法宣教對疑似肺結(jié)核病者，臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)通過解釋，使其充分了解標(biāo)本質(zhì)量對相應(yīng)檢查項(xiàng)目的重要性，示范并指導(dǎo)其掌握從肺部深處咳痰的方法；如患者識字，可提供宣教材料。3、地點(diǎn)由于當(dāng)患者咳嗽、咳痰時(shí)，易于產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠，感染周邊人群的機(jī)率較高，故采集痰標(biāo)本時(shí)應(yīng)在遠(yuǎn)離人群的開放空間進(jìn)行，或在通風(fēng)良好的室內(nèi)進(jìn)行?；颊吡羧〉奶禈?biāo)本，應(yīng)由檢驗(yàn)人員或經(jīng)培訓(xùn)的專人目視檢查標(biāo)本質(zhì)量（特別是用于初次診斷的痰標(biāo)本）。合格的痰標(biāo)本應(yīng)是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，標(biāo)本量一般在35 ml。干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色（或奶酪色）、膿樣、團(tuán)塊狀的肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時(shí)較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發(fā)現(xiàn)大量膿性炎癥細(xì)胞、肺上皮脫落細(xì)胞。由于此類標(biāo)本是由肺部深處咳出，對肺結(jié)核的診斷最有價(jià)值，故AFB的檢出率較高。血痰：此類標(biāo)本是因粘液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰的細(xì)胞特征外，含新鮮血液的標(biāo)本中可見到被染色的血細(xì)胞。由于含血標(biāo)本易干擾AFB鏡檢的結(jié)果，故在制片時(shí)應(yīng)盡量避免挑取含血標(biāo)本。粘液痰：標(biāo)本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片時(shí)需仔細(xì)涂抹；涂片染色后鏡檢時(shí)，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞（細(xì)胞較長且形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色均較深，細(xì)胞一端可見著色較淺的纖毛），伴有少量肺上皮脫落細(xì)胞（多數(shù)為圓形、細(xì)胞核較小且著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比大于 1:3）、膿性炎癥細(xì)胞（卵圓形、細(xì)胞核占細(xì)胞比例較大且著色較深，核質(zhì)比低于 1:1）、口腔脫落細(xì)胞及口腔寄生菌。此類標(biāo)本的AFB檢出率較唾液高。唾液：目視觀察標(biāo)本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時(shí)伴有氣泡；涂片染色鏡檢時(shí)，鏡下可見少量口腔上皮脫落細(xì)胞（形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核著色較細(xì)胞質(zhì)深，核質(zhì)比接近或大于 1:2）和口腔內(nèi)寄生菌，有時(shí)可見食物殘?jiān)?。由于此類?biāo)本進(jìn)行AFB檢查時(shí)的檢出率很低，用于對患者確定診斷時(shí)是不合格的標(biāo)本。合格的痰標(biāo)本一般為干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰。痰標(biāo)本不合格時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步指導(dǎo)并要求病人重新送檢。進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查時(shí)應(yīng)在登記本和檢驗(yàn)報(bào)告單上注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時(shí)參考。直接涂片檢查檢查對象根據(jù)檢查目的分為兩類：確定診斷，發(fā)現(xiàn)傳染源；療效評價(jià)，作為確定化療方案和治療效果評價(jià)的指標(biāo)。（1）確定診斷：凡因結(jié)核病癥狀求診及轉(zhuǎn)診的可疑肺結(jié)核患者，均應(yīng)進(jìn)行痰涂片檢查。確定診斷的涂片檢查應(yīng)采集3個(gè)合格的痰標(biāo)本。就診當(dāng)時(shí)在門診留一份“即時(shí)痰”標(biāo)本，同時(shí)給患者2個(gè)痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗(yàn)。（2）療效評價(jià)：凡已確診、登記、治療的肺結(jié)核患者，在化療期間按照規(guī)定應(yīng)定期查痰： 初治涂陽患者在療程強(qiáng)化期末、繼續(xù)期滿3個(gè)月和繼續(xù)期結(jié)束時(shí)（一般為治療后的第2、5和6個(gè)月）；復(fù)治涂陽患者在療程強(qiáng)化期末、繼續(xù)期滿3個(gè)月和繼續(xù)期結(jié)束時(shí)（一般為治療后的第2、5和8個(gè)月）分別收集一份晨痰和即時(shí)痰進(jìn)行涂片檢查。 初、復(fù)治涂陽患者在療程強(qiáng)化期結(jié)束時(shí)，痰菌仍為陽性者，應(yīng)在1個(gè)月時(shí)增加痰涂片檢查一次；若復(fù)治涂陽患者治療滿3個(gè)月時(shí)痰菌仍陽性，應(yīng)在治療滿5個(gè)月增加痰涂片檢查一次。 確診、登記的涂陰肺結(jié)核患者，即使患者因故未接受治療，也應(yīng)在登記后滿2和6個(gè)月時(shí)進(jìn)行痰菌檢查（一）玻片的制備1、用于抗酸菌（AFB）檢查的載玻片要求（1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。（2）每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片檢查。（3）應(yīng)使用以95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無油污、無劃痕的新載玻片制備涂片，在玻片背面一端的1/3處注明實(shí)驗(yàn)室序號及標(biāo)本序號（如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。2、制備涂片（1）小心打開承載痰標(biāo)本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢。（2）仔細(xì)觀察標(biāo)本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.050.1 ml，于玻片正面右側(cè)2/3處，均勻涂抹成1020 mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置自然干燥后（一般約需要30分鐘）進(jìn)行染色鏡檢。（3）涂抹完畢后的痰標(biāo)本，在結(jié)果報(bào)告前應(yīng)暫時(shí)保留。（4）為了保證檢驗(yàn)人員的安全，嚴(yán)禁在涂抹痰標(biāo)本的同時(shí)，對載玻片進(jìn)行加熱。（二）染色1、萋爾尼爾遜染色法（Ziehl-Neelson），簡稱萋尼氏染色法（Z-N）（1）試劑的配制： 石碳酸復(fù)紅染色液： 堿性復(fù)紅儲存液：堿性復(fù)紅8g加95%酒精至100 ml，充分振蕩使復(fù)紅溶解。5%石碳酸水溶液：40-50水浴加熱石碳酸使之融解，取5 g液態(tài)石碳酸溶于90ml熱蒸餾水中，待溶液冷卻至室溫時(shí)，補(bǔ)充蒸餾水至100 ml。石碳酸復(fù)紅工作液：10 ml經(jīng)定性濾紙過濾的堿性復(fù)紅儲存液與90 ml 5%石碳酸水溶液充分振蕩、混合均勻后，使用定性濾紙過濾。 5%鹽酸乙醇脫色液：5 ml濃鹽酸（35%）與95 ml95%乙醇混合。 亞甲蘭復(fù)染液：儲存液：0.3 g亞甲蘭溶于50 ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。亞甲蘭復(fù)染液：以蒸餾水3倍稀釋0.3%亞甲蘭儲存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲蘭的終濃度為0.1%。使用定性濾紙過濾，即得亞甲蘭復(fù)染液。（2）染色步驟： 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10 mm 以上的距離；火焰固定（在5秒鐘內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。 滴加石碳酸復(fù)紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時(shí)可續(xù)加染色液。加溫時(shí)勿使染色液沸騰。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標(biāo)本上剩余的水。 自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色3分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。 滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液，染色30秒鐘。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復(fù)染液，然后瀝去標(biāo)本上剩余的水。待玻片干燥后鏡檢。 一張染色合格的玻片，由于被亞甲蘭染色而呈亮藍(lán)色。將染色后的玻片放置在報(bào)紙上，如果透過痰膜不能分辨報(bào)紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚。2、熒光染色法AFB采用熒光染色法鏡檢，只限于那些每日工作量較大（日讀片數(shù)超過25張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員閱讀熒光染色玻片具有豐富經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室開展。（1）試劑配制： 染色劑（金胺O染液）：金胺O1g石碳酸50ml乙醇100ml補(bǔ)蒸餾水至1000ml 金胺O（auramine O，分子式為C17H21N3HCl）：用于AFB染色時(shí)必須使用最低染料含量約80的生物染色劑。 脫色劑：3%鹽酸乙醇（配制方法參照萋尼氏染色）。 復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。（2）染色步驟： 玻片經(jīng)火焰固定后,滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。 自痰膜上端外緣滴加脫色劑，布滿痰膜，脫色3分鐘或至無色, 流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。 滴加復(fù)染劑復(fù)染2分鐘，瀝去復(fù)染液，自然干燥，準(zhǔn)備鏡檢。（三）鏡檢1、萋尼氏染色玻片鏡檢使用10目鏡雙目顯微鏡讀片。取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40物鏡，轉(zhuǎn)動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調(diào)節(jié)至適當(dāng)亮度，調(diào)節(jié)焦距至可見細(xì)胞形態(tài)；移開40物鏡，在玻片上滴12滴鏡油，使用100油鏡進(jìn)行細(xì)致觀察。在淡藍(lán)色背景下，抗酸菌呈紅色；其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。為防止AFB的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。由于香柏油（cedarwood immersion oil）能夠溶解復(fù)紅染料，使萋尼氏染色退色，并且容易干燥凝結(jié)，對油鏡頭造成損害；故推薦使用專門用于100油鏡、不干燥、不變硬的鏡油（immersion oil）。讀片時(shí)，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰的視野；當(dāng)玻片移動至痰膜一端時(shí)，縱向向下轉(zhuǎn)換一個(gè)視野，然后從右向左觀察，依此類推。通常20 mm的痰膜，使用100油鏡，每行可觀察約100個(gè)視野。仔細(xì)觀察完300個(gè)視野，一般需要5分鐘以上；每個(gè)工作日，一位鏡檢人員的玻片閱讀量不要超過25張，且連續(xù)閱讀1012張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。2、熒光染色玻片鏡檢玻片放置在玻片臺上并以卡尺固定后，首先以10目鏡、20物鏡進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為AFB的桿狀熒光顆粒時(shí)，使用40物鏡確認(rèn)。在暗背景下，抗酸菌發(fā)出桿狀熒光。相應(yīng)波長光線激發(fā)染料產(chǎn)生可視光的能力，隨著時(shí)間而衰減。故熒光染色后的涂片應(yīng)于當(dāng)日鏡檢；如果玻片數(shù)量過多，應(yīng)將涂片放置于4避光保存，次日必須完成鏡檢。（四）結(jié)果報(bào)告1、萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)抗酸桿菌陰性（）：連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù)：12條抗酸桿菌/300視野。抗酸桿菌陽性（1）：39條抗酸桿菌/100視野?？顾釛U菌陽性（2）：19條抗酸桿菌/10視野?？顾釛U菌陽性（3）：19條抗酸桿菌/每視野。抗酸桿菌陽性（4）：10條抗酸桿菌/每視野。2、熒光染色鏡檢結(jié)果分級報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)熒光染色抗酸桿菌陰性 （-）：0條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（報(bào)告抗酸菌數(shù)）：13條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10