質(zhì)譜 內(nèi)標等知識.doc

質(zhì)譜定量的原則 內(nèi)標的選擇LC-MS 2009-11-01 19:44:11 閱讀178 評論2 字號：大中小訂閱 質(zhì)譜定量的原則04系列講座 內(nèi)標 在做MS定量時應該使用內(nèi)標。選擇一個合適的內(nèi)標，將能減少因為樣品提取、HPLC進樣和離子化的多樣性造成的差異。在復雜基質(zhì)的分析中，在SRM積分圖上，在標準曲線的低端，常會見到：兩個不同的濃度水平，會給出近乎一致的響應。只有當使用一種內(nèi)標時，這兩個點才能被區(qū)分。一些研究者試圖在實驗中不用內(nèi)標去做標準曲線，但成功率不高。我們在標準曲線上每個濃度水平都重復進樣3次。沒有內(nèi)標的情況下，重現(xiàn)性RSD常常會高于20%；而當使用內(nèi)標時，%RSD能降低到近2%。我要如何選擇一個內(nèi)標?最好的內(nèi)標是待定量的化合物的同位素內(nèi)標。同位素標記的內(nèi)標將和待測物有相似的回收率、ESI離子化響應，和相似的色譜保留時間。如果你運行的不是臨床藥代動力學定量，可能很難判斷上述說法，因為特殊的合成一個同位素標記的內(nèi)標，是非常昂貴和耗時的。通常，如果你和一個醫(yī)學的化學家工作，他們會有一個化合物相似物庫，可以被用作內(nèi)標。這些類似物，在化合物合成中被測試，和該化合物性質(zhì)相似可以被用戶定量內(nèi)標，而且更重要的是，這些類似物和該化合物的母離子質(zhì)量有微小的差異。盡量不要使用去甲基化（14）或者是氧化的（16）的類似物作內(nèi)標，因為待測化合物的母離子常會發(fā)生同樣的代謝。常見的做內(nèi)標的類似物是氯代的化合物。氯代的化合物類似物會和待測化合物有相似的色譜保留時間，這是內(nèi)標的一個重要特性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)標物的一個最重要的特性是它和待測化合物共流出。我該如何使用內(nèi)標？首先，內(nèi)標添加需在樣品測試方法的開始階段，典型的，應在血漿crash或固相萃取之前。內(nèi)標應用同一濃度水平添加（包括標樣）。內(nèi)標應給出可靠的質(zhì)譜響應。應該注意的是：內(nèi)標的量應添加得合適，應高于定量限，但不能過高，因為過高的內(nèi)標響應會抑制被分析物的離子化?！拔覒撎砑佣嗌倭康膬?nèi)標？”這是一個重要的問題。通過做一些試分析：早、中、晚的時間點，也許一個或兩個標準點，你應該知道你的樣品中化合物的大概量。這些信息非常有價值，可以幫助建立一個合適的標準曲線，并知道應添加多少量的內(nèi)標。舉例來說：如果待定量的樣品濃度范圍是100 fg 25 pg，檢測限是100 fg，你應該添加510 pg的內(nèi)標。一個好的經(jīng)驗法則是：內(nèi)標物的量大概是標準工作曲線濃度最高點的1/3。這將給出一個比較不錯的響應，并且不會抑制和干擾待測樣品的離子化。見圖1內(nèi)標.gif圖1 內(nèi)標的量 大規(guī)模質(zhì)譜法簡介 目前， 研究人員 們正在通過各種方法使大規(guī)模 質(zhì)譜 法變得更有效，而且將這一技術工具縮小化。 大規(guī)模 質(zhì)譜法 對于藥物的發(fā)現(xiàn)來說是一個無法比擬的有力工具，而且它在定性與 定量分析 的應用中有著很大的價值。雖然大規(guī)模質(zhì)譜法的應用能力和敏感性被不斷的改進，但是在藥物發(fā)現(xiàn)研究里面的技術改革只是出現(xiàn)在專門的工具和應用中。這一技術工具的發(fā)展有著三大趨勢：減少 樣品處理 與準備工作，輔以數(shù)據(jù)分析，促進可攜帶性和多 功能性 。 樣品處理 樣品處理和準備是 質(zhì)譜技術 分析中最耗體力的步驟。通常，要獲得一個足夠純度的樣品需要兩個或更多的分離步驟。市場上的許多儀器通過整合一個化學分離步驟來減少這些勞動量。市場上最新的能大幅減輕勞動量的技術是由日本Shimadzu 公司的 科學家 改進的，這一技術通過機械化樣品處理和化學噴墨打印機，被用于直接分析Western blot 實驗中的蛋白。Shimadzu 科學家用化學打印法在Western blot薄膜上點上 胰島素 來消化蛋白質(zhì)，然后應用基質(zhì)溶液和 基質(zhì)輔助 激光解吸離子化快速質(zhì)譜技術（MALDI-TOF）對膜上的樣品進行直接 質(zhì)譜分析 。 通過以上分析， 研究員 能夠從一次 免疫印跡 實驗中的任意多個點得到蛋白質(zhì)質(zhì)譜印記，PMF數(shù)據(jù)，或整個蛋白質(zhì)情況。Shimadzu 科學家約瑟夫.?？怂共┦空f：“你能通過一個blot分析做很多事情?？梢韵胂竦玫剑@一技術不僅使藥物或小分子 化合物 的找尋工作得以很好的進行，并且對于生物標記或蛋白質(zhì)的找尋工作也有同樣的作用?！盨himadzu 說這一方法的優(yōu)勢在于對于一個蛋白質(zhì)，其質(zhì)量的數(shù)據(jù)能從它最初被識別的blot中提取,并非跑一塊新膠切下條帶用于質(zhì)譜分析。探索一塊凝膠上的大量難懂的條帶需要花費幾個月的時間，而這項技術通過從Western blot中提取PMF數(shù)據(jù)可以節(jié)省時間并且排除人為錯誤。 自動化 、機械化和最小的樣品處理也是Shimadzu 的新器具LCMS-IT-TOF的主要特點。 這一儀器在離子噴入 TOF 室前通過一個四級桿離子陷阱 探測器 聚焦于離子，因此有著極高的敏感性。 LC/MS能與一個自動取樣器一起進行流水化工作。Shimadzu 的HPLC產(chǎn)品經(jīng)理Chris Campbell說：“在把樣品放在 質(zhì)譜儀 器里之前，人們總是希望盡可能少對樣品做處理。樣品自動清理是許多質(zhì)譜儀器使用者夢寐以求的事情。” 軟件分析 第二個快速革新的領域是質(zhì)譜技術的軟件包。在過去幾年中，質(zhì)譜技術器具敏感性和生產(chǎn)量都得到提高，使得人工數(shù)據(jù)分析的勞動強度越來越大。生物系統(tǒng)的應用促進了新的敏感型的四級桿 飛行時間 Qstar Elite LC/MS/MS TOF 質(zhì)譜儀上市。依照公司、軟件特征與器具聯(lián)合使工作流程流線化，而且能更理性的收集數(shù)據(jù)。以 代謝物 表面構型確定為目標的Qstar，據(jù)報道能夠以最快每秒七個前體離子的速度獲得完全掃描的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。它的獨立數(shù)據(jù)獲得軟件的特色是一個專有的算法，這個算法叫做動態(tài)背景減少算法（DBS）,該算法能夠使質(zhì)譜儀為收集數(shù)據(jù)而選擇離子時變得“更聰明”。這個算法收集了20個調(diào)查掃描而且分析了那些掃描中出現(xiàn)的所有離子。與一條相對于時間的強烈的衰退線對比，以最大速度上升的離子能夠被選取作為MS/MS數(shù)據(jù)的收集。 第二個數(shù)據(jù)管理技術叫做質(zhì)量差引發(fā)獨立數(shù)據(jù)獲得技術（MDT IDA）。這一技術通過對比前體化合物與代謝產(chǎn)物在代謝物表面結構確定中的質(zhì)量差，進一步減少用于MS/MS數(shù)據(jù)獲得的可選化合物數(shù)量。 快捷便利 奧地利 的Biocrates 生命科學 公司已經(jīng)開發(fā)了一個平臺，可以用來從液體樣品（如尿液，血漿，或是 細胞培養(yǎng) 液）中 一次性 識別并定量1,000多種代謝物。Biocrates稱，這種工具已經(jīng)超越了采用美國應用生物系統(tǒng)公司的設備提供的數(shù)據(jù)過濾工具，能夠一次性對整個代謝過程進行全面分析。Biocrates公司首席執(zhí)行官 Armin Graber表示，采用最前沿的自動化樣品 預處理 工具，公司已經(jīng)為一些疾病地區(qū)快速直接的 代謝組學 分析創(chuàng)立了方法。根據(jù)Graber所說，這間只有15名職員的公司一天能做500個樣品。他還說：“我們已經(jīng)選擇好了代謝產(chǎn)物,我們預先知道該使用哪些設備，哪一個生化途徑起了作用，哪些疾病是相關的。我們預先注釋了我們所有的代謝信息。” Graber說：“蛋白質(zhì)的一大優(yōu)勢是體內(nèi)有很多不同的修飾變體。因此即使你試著分析識別他們，如果這其中有一個蛋白質(zhì)的豐度比起其它來說高了極多，解釋起來就比較困難。在代謝中，這類蛋白是一種從功能上講的代謝終點。如果代謝產(chǎn)物濃度很高,只能說明它濃度是高的。如果它是反應的終點,你應該知道反應出了問題。這就需要對此做一個更直接的解釋。”如果公司們想制作出超越標準容量的軟件包，它們就必須發(fā)展自己的 信息技術 ?！皼]有人以1,000個代謝產(chǎn)物為目標方式。其他的公司只以兩個代謝產(chǎn)物為目標。” Thermo公司于2006年2月推出了一款用于質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)組增強版工具。這些包括了Pulsed-Q Dissociation （PQD），用于解決 離子阱 中小質(zhì)量蛋白質(zhì)切割問題，還包括一個BioWorks 軟件包的擴大版本，它整合了通過反應物鑒別蛋白質(zhì)的方法。詳細敘述了從人類HL-60細胞系的微粒片段中鑒別蛋白質(zhì)的方法。實驗的目的是找出細胞從非黏著狀態(tài)到黏著狀態(tài)的變化特征，以及加入卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）后的狀態(tài)延伸特征。David K. Han博士等人在實驗中，將 同位素 標記的親和標簽（iCAT）與蛋白質(zhì)共價相連，使用 SEQUEST 數(shù)據(jù)分析工具，用自動 串聯(lián)質(zhì)譜 儀分析得出結果。該作者說：“這代表了最大數(shù)量的膜或是膜偶聯(lián)蛋白的數(shù)據(jù)