牛奶中活性物質(zhì)的分析

牛奶中活性物質(zhì)的分析 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1牛奶中水分含量的測定2牛奶中粗脂肪的提取與測定 3牛奶中酪蛋白的提取4蛋白質(zhì)含量的測定 1 牛奶中水分含量的測定 水分是食品分析的重要項(xiàng)目之一 水分測定對于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡 和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面 有很重要的意義 各種食品水分的含量差別很大 例如 鮮果為69 7 92 5 鮮菜為79 7 97 1 鮮瘦肉52 6 77 4 面粉12 14 面包水分隨品種不同略有差異 一般為32 42 水分測定法通?？煞譃橹苯臃ê烷g接法兩類 利用水分本身的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)測定水分的方法 叫做直接法 如重量法 蒸餾法和卡爾 費(fèi)休法等 利用食品的比重 折射率 電導(dǎo) 介電常數(shù)等物理性質(zhì)測定水分的方法 叫做間接法 測定水分的方法要根據(jù)食品的性質(zhì)和測定目的來選定 一重量法 凡操作過程中包括有稱量步驟的測定方法 統(tǒng)稱為重量法 如烘箱干燥法 紅外線干燥法 干燥劑法等 烘箱干燥法在一定溫度和壓力條件下 將樣品加熱干燥 以排除其中水分的方法 叫做烘箱干燥法 它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法 這種測定方法費(fèi)時長 但操作簡便 應(yīng)用范圍較廣 應(yīng)用本法測定水分的樣品應(yīng)符合下述條件 1 水分是唯一的揮發(fā)物質(zhì) 2 水分的排除情況很完全 3 食品中其他組分在加熱過程中由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而引起的重量變化可以忽略 二材料與儀器 材料全脂牛奶層析濾紙器材常壓電熱烘箱干燥器電子分析天平 三操作步驟 取一張12cm 12cm70 過夜烘干的層析濾紙 稱重 記為m1 準(zhǔn)確稱取一定量牛奶m2 滴于濾紙上 70 烘干后稱重 記為m3 計(jì)算水分含量 干物質(zhì)質(zhì)量m4 m3 m1水分含量 m2 m4 m2 100 2 粗脂肪的定量測定 索氏提取法一 目的要求學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測定法 索氏提取法 二 原理脂肪是丙三醇 甘油 和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物 能溶于脂溶性有機(jī)溶劑 本實(shí)驗(yàn)用重量法 利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性 用脂溶性溶劑將脂肪提取出來 借蒸發(fā)除去溶劑后稱量 整個提取過程均在索氏提取器中進(jìn)行 通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點(diǎn)為30 C 60 C的石油醚 用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外 還含有游離脂肪酸 磷酸 固醇 芳香油及某些色素等 故稱為 粗脂肪 三 適用范圍與特點(diǎn) 適用于脂類含量較高 結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過的 結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài) 樣品應(yīng)能烘干 磨細(xì) 不易吸濕結(jié)塊 此法經(jīng)典 對大多數(shù)樣品的測定結(jié)果比較可靠 但費(fèi)時長 8 16h 溶劑用量大 需要專門的儀器 索氏提取器 四材料 試劑與器材材料 全脂牛奶試劑 乙醚器材 索氏提取器 干燥箱 電子分析天平 索氏提取器構(gòu)造 五 操作方法1抽提筒的準(zhǔn)備2抽提將測定完水分帶有干物質(zhì)的濾紙折成小包放入抽提筒 再放入索氏抽提器內(nèi) 連接已干燥至恒重 m5 的脂肪接受瓶 由冷凝管上端加入無水乙醚 加量為接受瓶的2 3體積 于60 水浴上加熱 使乙醚不斷的回流提取 一般視含油量高低提取6 12小時 至抽提完全為止 用濾紙?jiān)?3稱重 取下接受瓶 回收乙醚 待接受瓶內(nèi)乙醚剩1 2ml時 在水浴上蒸干 再于100 105 干燥2小時 取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘 稱重 并重復(fù)操作至恒重 m6 取出濾紙包 于戶外晾至無乙醚味 置入恒溫箱內(nèi) 烘干 然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重 重復(fù)操作至恒重 m7 六結(jié)果處理 方法一脂肪 m6 m5 m4 100m6 接受瓶和脂肪的質(zhì)量 g m5 接受瓶的質(zhì)量 g m4 樣品的質(zhì)量 如為測定水分后的樣品質(zhì)量計(jì) g 方法二脂肪 m3 m7 m4 100m3 未抽提濾紙包的質(zhì)量 g m7 抽提后濾紙包的質(zhì)量 g m4 樣品的質(zhì)量 如為測定水分后的樣品質(zhì)量計(jì) g 七 注意事項(xiàng)乙醚為易燃有機(jī)溶劑 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火 抽提用的乙醚或石油醚要求無水 無醇 無過氧化物 揮發(fā)殘?jiān)康?因水和醇可導(dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解 如水溶性鹽類 糖類等 使得測定結(jié)果偏高 被測樣品也要事先烘干 過氧化物會導(dǎo)致脂肪氧化 在烘干時也有引起爆炸的危險(xiǎn) 裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密 不能往外漏樣品 也但不要包得太緊影響溶劑滲透 放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管 否則超過彎管的樣品中的脂肪不能提盡 造成誤差 八 思考題 1 本實(shí)驗(yàn)制備得到的是粗脂肪 若要制備單一組分的脂類成分 可用什么方法進(jìn)一步處理 2 本實(shí)驗(yàn)樣品制備時烘干為什么要避免過熱 3 酪蛋白的提取一 目的要求掌握一種提取酪蛋白的方法掌握一種檢測牛乳質(zhì)量的方法 二實(shí)驗(yàn)原理 酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì) 占乳蛋白的80 82 酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì) 是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物 以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合 它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸 但不含半胱氨酸 它在牛乳中的含量約為35g L 比較穩(wěn)定 利用這一性質(zhì)可以檢測牛乳中是否摻假 酪蛋白在其等電點(diǎn)時由于靜電和為零 同種電荷間的排斥作用消失 溶解度很低 利用這一性質(zhì) 將牛乳調(diào)到pH4 6 酪蛋白就可從牛乳中分離出來 酪蛋白不溶于乙醇 這個性質(zhì)被用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去 三儀器 原料和試劑 儀器 溫度計(jì) 布氏漏斗 pH試紙 抽濾瓶 水浴鍋 燒杯 量筒 表面皿 天平 離心機(jī)等原料 市售全脂牛奶試劑 無水乙醇 無水乙醚pH4 7乙酸鈉緩沖液0 2mol L乙醇 乙醚混合液 乙醇 乙醚 1 1 體積比 四實(shí)驗(yàn)步驟 1 酪蛋白等電點(diǎn)沉淀將100mL牛乳放到500mL燒杯中 加熱到40 加入到同樣40 的乙酸鈉緩沖液中 調(diào)pH達(dá)4 7 此時有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出 將懸浮液冷卻至室溫 室溫放置分層 3000r min離心15min 收集沉淀 2 水洗將pH4 7醋酸 醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍 洗滌粗制品三次 分別離心10分鐘 得到沉淀蛋白 3 去脂將粗制品中加入10ml無水乙醇 攪拌片刻 將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中 用乙醚 乙醇混合液洗滌沉淀兩次 最后用乙醚洗沉淀2次 抽干 將沉淀從布氏漏斗中移去 在表面皿上攤開以除去乙醚 干燥后得到的是酪蛋白純品 準(zhǔn)確稱重后 計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量 g 100mL 并與理論產(chǎn)量 3 5g 100mL 相比較 求出實(shí)際獲得百分率 五思考題 用乙醇 乙醇 乙醚和乙醚洗滌蛋白質(zhì)的順序是否可以變換 為什么 試設(shè)計(jì)一個利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn) 六離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng) 離心機(jī)的工作原理 在離心力場的作用下 可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度 從而將不同的物質(zhì)分離 它是生化實(shí)驗(yàn)中提取 分離 純化的常用設(shè)備 操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡 注意事項(xiàng)1 檢查內(nèi) 外套管應(yīng)完整不漏 洗凈離心管 2 待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過離心內(nèi)套管體積的2 3 3 將一對離心管 含內(nèi) 外套管 放在臺秤上平衡 4 檢查離心機(jī)正常后 將平衡好的離心管對稱的放在離心機(jī)中 5 蓋好離心機(jī)蓋 打開電源開關(guān) 設(shè)置轉(zhuǎn)速與時間 開始離心 注意一定不能超過離心機(jī)的最大離心速度 離心結(jié)束后 待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后 再打開機(jī)蓋 取出離心管 不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn)6 用完后 將內(nèi)外套管洗凈 倒立放置 使其干燥 并在使用的登記薄簽名 7 使用過程中 如出現(xiàn)故障 一定請本室的實(shí)驗(yàn)員排除 不許擅自處理 4 蛋白質(zhì)濃度的測定 考馬斯亮藍(lán)染色法 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會用考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合 這種結(jié)合具有高敏感性 考馬斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色 最大吸收峰在465nm 當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍(lán)色 最大吸收峰改變?yōu)?95nm 考馬斯亮藍(lán)G250 蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度 比Lowry法靈敏4倍 在一定范圍內(nèi) 蛋白質(zhì)和染料考馬斯亮藍(lán)結(jié)合符合比爾定律 因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量 二實(shí)驗(yàn)原理 CoomassieDye Based蛋白質(zhì)定量 三實(shí)驗(yàn)試劑與器材 試劑0 9 NaCl溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白液 牛血清白蛋白 0 1mg ml 染液 考馬斯亮藍(lán)G250 0 01 樣品液 酪蛋白溶液器材漩渦混合器試管吸管容量瓶量筒電子分析天平比色皿722型分光光度計(jì) 四 操作方法1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取14支試管 分兩組按下表平行操作 試管編號0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 mL 00 10 20 30 40 50 60 9 NaCl溶液 mL 1 00 90 80 70 60 50 4考馬斯亮藍(lán)試劑 mL 4444444蛋白質(zhì)濃度 g mL 0102030405060A595nm搖勻 1h內(nèi)以0號試管為空白對照 在595nm處比色OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo) 在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 2 酪蛋白濃度的測定稱取一定量的酪蛋白 用0 9 NaCl溶液溶解定容至一定體積 使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi) 測定方法同上 根據(jù)所測定的OD595nm值 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量 從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度 g mL 五注意事項(xiàng) 1 如果測定要求很嚴(yán)格 可以在試劑加入后的5 20min內(nèi)測定光吸收 因?yàn)樵龠@段時間內(nèi)顏色最穩(wěn)定 2 測定中 蛋白 染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上 但此復(fù)合物的吸附量可以忽略 測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈 3 一些陽離子如K Na Mg2 乙醇等物質(zhì)對測定無影響 而大量的去污劑如SDS等會嚴(yán)重干擾測定 六722型分光光度計(jì)使用方法 1 調(diào)整 1 將靈敏度旋鈕調(diào)至 1 檔 放大倍率最小 調(diào)波長調(diào)節(jié)器至所需波長 2 開啟電源開關(guān) 指示燈亮 選擇開關(guān)置于 T 調(diào)節(jié)透光率 100 T 旋鈕使數(shù)字顯示 100 0 左右 預(yù)熱20min 2 校正 1 打開吸收池暗室蓋 光門自動關(guān)閉 調(diào)節(jié) 0 T 旋鈕 使數(shù)字顯示為 00 0 蓋上吸收池蓋 將參比溶液置于光路 使光電管受光 調(diào)節(jié)透光率 100 T 旋鈕 使數(shù)學(xué)顯示為 100 0 2 如果顯示不到 100 則可適當(dāng)增加電流放大器靈敏度檔數(shù) 但應(yīng)盡可能使用低檔數(shù) 這樣儀器將有更高的穩(wěn)定性 當(dāng)改變靈敏度后必須重新校正 0 和 100 3 按 1 連續(xù)幾次調(diào)整 00 0 和 100 0 后 如將選擇開關(guān)置于 A 調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕 使數(shù)字顯示為 000 即可進(jìn)行下面吸光度A的測量 如將選擇開關(guān)置于 C 將標(biāo)準(zhǔn)溶液推入光路 調(diào)節(jié)濃度旋鈕 使得數(shù)字顯示值為已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度數(shù)值 即可進(jìn)行下面濃度c的測量 3 測定 吸光度 的測量 將要測 的試樣溶液推入光路 顯示值即為待測樣品的吸光度值 濃度c的測量 將要測c試樣溶液推入光路 即可讀出待測樣品的濃度值c 4 結(jié)束測量完畢 關(guān)閉電源 將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置 取出吸收池洗凈 晾干 存于