動物細胞培養(yǎng)技術PPT課件

1 動物細胞培養(yǎng)技術 2 1 動物細胞的生長與培養(yǎng) 動物細胞的特點進化程度高結構 形態(tài) 成分復雜細胞間連接形式多樣生長相對緩慢功能全面 3 1 1培養(yǎng)細胞的生物學特征 Hepatocytes 4 體外培養(yǎng)細胞的分型 一 貼附型成纖維細胞型上皮型細胞游走細胞型多形型細胞 二 懸浮型 三 半貼壁型 5 一 貼附型 大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長 屬于貼壁依賴性細胞貼附 是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結果 基于貼附特性 使細胞與細胞之間相互結合形成組織 有機體的絕大多數(shù)細胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長 培養(yǎng)時 這些細胞被放到體外環(huán)境中以后 同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長 因而屬于貼附型細胞貼附 錨定或錨著 依賴型 性 細胞 唯有貼附于固相表面才能生存的細胞 6 細胞在體內(nèi) 外的貼附方式 存在差異體內(nèi) 貼附是全方位 外形具有復雜的立體特征體外 多數(shù)情況 細胞只有一個附著平面 外形一般與體內(nèi)時明顯不同貼附的固相表面 玻璃 聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài) 可分為幾大類型 7 1 成纖維細胞型 8 名稱 凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源 由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如 真正的成纖維細胞 心肌 平滑肌 成骨細胞 血管內(nèi)皮形態(tài) 似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出2 3個長短不等的突起 中有卵圓形核生長特點 排列成放射狀 漩渦狀 并不緊靠連成片 細胞 細胞接觸易斷開而單獨行動 游離的單獨的成纖維樣細胞 常有幾個伸長的細胞突起 9 2 上皮型細胞 10 名稱 僅形態(tài)上似體內(nèi) 實際上不完全相同來源 來源于外胚層 內(nèi)胚層細胞 如 皮膚及其衍生物 消化道 乳腺 肺泡 上皮性腫瘤形態(tài) 類似體內(nèi)的上皮細胞 扁平 不規(guī)則多角形 中有圓形核生長特點 易相連成片 相靠 緊密相連 成薄層 鋪石狀生長時呈膜狀移動 很少脫離細胞群而單個活動 11 3 游走細胞型 呈散在生長 一般不連成片 胞質(zhì)常突起 呈活躍游走或變形運動 方向不規(guī)則 此型細胞不穩(wěn)定 有時難以和其他細胞相區(qū)別 4 多型細胞型 有一些細胞 如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài) 可統(tǒng)歸于此類 12 二 懸浮型 見于少數(shù)特殊的細胞 如某些類型的癌細胞及白血病細胞 胞體圓形 不貼于支持物上 呈懸浮生長 這類細胞容易大量繁殖 概念 培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源 自血 脾或骨髓 血中白細胞癌腫細胞特點 在懸浮中生長良好細胞圓形 單個或小細胞團優(yōu)點 生存空間大 提供數(shù)量大 傳代方便 不需消化 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點 純化不方便 不能通過離心將死 活細胞分離 13 14 無菌無毒害的環(huán)境 1 支持生長增殖的營養(yǎng) 2 其它類似體內(nèi)的環(huán)境 3 維持細胞性狀 4 1 2細胞培養(yǎng)總原則 15 一 細胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境 實驗室設計合理常用設施及設備培養(yǎng)器皿 透明度好 無毒 利于細胞貼附和生長的材料 常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品 16 17 細胞培養(yǎng)無菌操作基本技術 工作環(huán)境及表面的處理細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細胞的處理 18 二 細胞的營養(yǎng) 培養(yǎng)基 合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一 培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎物質(zhì) 而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境 血清 血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一 含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分 其它成分 條件培養(yǎng)基 19 合成培養(yǎng)基的主要成分 氨基酸碳水化合物無機鹽維生素其它輔助物質(zhì) 培養(yǎng)基種類 RPMI 1640 標準型 DMEM 高糖 標準型 DMEM 低糖 標準型 McCoys5AM199F12 20 血清 牛血清 馬血清 人血清 1 儲存于 20 70 低溫冰箱中 2 一般廠商提供的血清為無菌 3 熱滅活是指56 30分鐘加熱已完全解凍的血清 目的是使血清中的補體成分 complement 滅活 4 血清中的沉淀物絮狀物 可用離心3000rpm 5分鐘去除 也可不用處理 21 其它常用液體試劑 Hank sD Hank sPBSNaHCO3 7 5 胰酶溶液 0 25 22 三 其它類似體內(nèi)的環(huán)境 溫度氣體滲透壓氫離子濃度 PH 其他 23 四 合理的計劃 維持細胞性狀 盡早凍存原代細胞 復蘇后狀態(tài)恢復的細胞以及轉染后穩(wěn)定存在的細胞需要做實驗的細胞要選對數(shù)生長期防止細胞污染 如遇污染 及時處理 24 一 細菌污染細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染 即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素 一般為預防劑量 也可能因為操作不慎而引起污染 最常見的有革蘭氏陽性菌 培養(yǎng)細胞受細菌污染后 會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁 pH改變 也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變 只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染 所以 每天應仔細觀察 污染后細胞發(fā)生病理改變 胞內(nèi)顆粒增多 增粗 最后變圓脫落死亡 造成試驗失敗和細胞株 系 丟失 25 二 真菌污染真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種 尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染 最常見的真菌有煙曲霉 黑曲菌 孔子霉 毛霉菌 白色念珠菌和酵母菌 培養(yǎng)細胞受真菌污染后 可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點 有的散在生長 培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁 倒置顯微鏡下可見絲狀 管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中 有的呈鏈狀排列 念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間 個體細小 有增多趨勢 鏡下看時 要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈 以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆 真菌污染后 細胞生長變慢 但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡 26 三 支原體污染支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物 最小直徑0 2 m 一般過濾除菌無法去除它 光鏡下難以看清它的形態(tài)結構 開始不易發(fā)現(xiàn) 能在偏堿條件 pH7 6 8 0 下生存 對青霉素有抗藥性 多吸附于細胞表面或散在于細胞之間 電鏡下可見其有三層結構 無細胞壁 中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊 培養(yǎng)細胞受支原體污染后 部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢 部分細胞變圓 從瓶壁脫落 但多數(shù)細胞污染后無明顯變化 或略有變化 若不及時處理 還會產(chǎn)生交叉污染 27 四 病毒污染采用組織細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗 如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物 會產(chǎn)生病毒污染 目前 從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng) 但生產(chǎn)疫苗是不安全的 若二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒 B淋巴細胞含EB病毒 細胞會發(fā)生變異 轉化 形成異倍體的細胞系 28 五 非同種細胞污染由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開 操作不當 往往會使一種細胞被另一種細胞污染 如 靈長類 細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物 ERK KD細胞是從兔腎中分離出來的 而現(xiàn)在卻認為是HeLa細胞 非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生 大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質(zhì)所致 29 常用的排除微生物污染的方法 抗生素排除法 采用5 10倍于常用量的沖擊法 加入高濃度抗生素后作用24 48h 再換入常規(guī)培養(yǎng)物 有時可能奏效 加溫除菌 根據(jù)支原體不耐熱的特點 可將受支原體污染的細胞至于41攝氏度作用5 10h 最長可達18h 以殺滅支原體 動物體內(nèi)接種 受污染的腫瘤細胞可接種在同種動物皮下或腹腔內(nèi) 利用動物的免疫功能消滅污染的微生物 而腫瘤細胞卻能在動物體內(nèi)繼續(xù)生長 待一定時間后從體內(nèi)取出腫瘤細胞進行培養(yǎng)與巨噬細胞共培養(yǎng) 巨噬細胞在體外可存活7 10天 并保持吞噬 消化微生物的能力 利用這一特點 可將少量的污染細胞與足夠量的巨噬細胞共培養(yǎng) 從而消除污染 30 1 3培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 幼齡動物 取動物器官和組織 剪碎組織 胰蛋白酶處理 細胞培養(yǎng) 單個細胞 31 如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 遺傳物質(zhì)改變 遺傳物質(zhì)未改變 32 原代培養(yǎng) 從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞 培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出 配制成細胞懸浮液 分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng) 稱為傳代培養(yǎng) 有關概念 33 細胞的原代培養(yǎng) 將動物機體的各種組織從機體中取出 經(jīng)各種酶 常用胰蛋白酶 螯合劑 常用EDTA 或機械方法處理 分散成單細胞 置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 使細胞得以生存 生長和繁殖 這一過程稱原代培養(yǎng) 34 組織塊直接培養(yǎng)法 機械法 1 取材 將小鼠拉頸椎致死 置75 酒精泡2 3秒鐘 時間不能過長 以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi) 再用碘酒消毒腹部 將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟 置平皿中 2 用Hank s液洗滌三次 并剔除脂肪 結締組織 血液等雜物 3 用手術剪將肝臟剪成小塊 1 2mm 再用Hank s液洗三次 轉移至小青霉素瓶中4 將組織塊轉移到培養(yǎng)瓶 貼附與瓶底面5 翻轉瓶底朝上 將培養(yǎng)液加至瓶中 培養(yǎng)液勿接觸組織塊 入37 靜置3 5小時 輕輕翻轉培養(yǎng)瓶 使組織浸入培養(yǎng)液中 勿使組織漂起 37 繼續(xù)培養(yǎng) 35 胰酶消化法 1 取材 將小鼠拉頸椎致死 置75 酒精泡2 3秒鐘 時間不能過長 以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi) 再用碘酒消毒腹部 將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟 置平皿中 2 用Hank s液洗滌三次 并剔除脂肪 結締組織 血液等雜物 3 用手術剪將肝臟剪成小塊 1mm2 再用Hank s液洗三次 轉移至小青霉素瓶中 4 視組織塊量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40分鐘 每隔5分鐘振蕩一次 5 加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用 或加入胰酶抑制劑 用吸管吹打 沖散細胞 6 靜置 使未分散的組織塊下沉 7 吸取上層細胞懸液 轉移到兩個培養(yǎng)皿中 補加適量培養(yǎng)液 37 下培養(yǎng) 36 一 培養(yǎng)細胞生命期在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間 37 1 原代培養(yǎng)期 從體內(nèi)取出組織 接種培養(yǎng)到第一次傳代階段 初代培養(yǎng) 特點 1一4周 細胞呈活躍的移動 可見細胞分裂 形態(tài)結構和功能活動上與體內(nèi)原組織相似性 多呈二倍體核型細胞群是異質(zhì)的 細胞克隆形成率很低 即細胞獨立生存性差 38 2 傳代期 初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系 在全生命期中此期的持續(xù)時間最長 在培養(yǎng)條件較好情況下 細胞增殖旺盛 并能維持二倍體核型 呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系 為保持二倍體細胞性質(zhì) 細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存 一般情況下當傳代10 50次左右 細胞增殖逐漸緩慢 以至完全停止 細胞進入第三期 39 3 衰退期 此期細胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 細胞形態(tài)輪廓增強 最后衰退凋亡 在細胞生命期階段 少數(shù)情況下 在以上三期任何一點 由于某種因素的影響 細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化 轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性 40 細胞永生性也稱不死性 即細胞獲持久性增殖能力 這樣的細胞群體稱無限細胞系 也稱連續(xù)細胞系 無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末 或第三期初階段 細胞獲不死性后 核型大多變成異倍體 細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā) 轉化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì) 細胞永生性和惡性性非同一性狀 41 二 組織培養(yǎng)細胞一代生存期 所謂細胞 一代 一詞 系指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間 這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法 它與細胞倍增一代非同一含義 如某一細胞系為第153代細胞 即指該細胞系已傳代153次 它與細胞世代或倍增不同 在細胞一代中 細胞能倍增3 6次 細胞傳一代后 一般要經(jīng)過以下三個階段 潛伏期指數(shù)生長期停滯期 42 1 潛伏期 43 過程 游離 懸浮 胞質(zhì)回縮 全部細胞變?yōu)閳A球形吸附 貼附底物 一般24小時內(nèi)貼壁潛伏期 可有運動活動 基本無增殖 少見分裂相 44 影響因素 潛伏期的長短與 細胞種類接種的細胞密度培養(yǎng)條件 45 1 細胞類型傳代培養(yǎng)的細胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短 傳代培養(yǎng)期的細胞6 24h 原代24 96h或更長單個細胞快 細胞大團慢 組織塊慢連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性轉化的細胞 6 24h 比有限細胞系與正常二倍體細胞的短來源 胚胎組織 短 2天可見細胞生長 成體 長 46 2 細胞密度密度越大 數(shù)量越多 細胞群體越容易適應體外環(huán)境 潛伏期就短 相反 即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi) 如接種的細胞數(shù)量不夠大 潛伏期仍會較長3 培養(yǎng)條件培養(yǎng)液 pH底物 污染 有毒 47 2 指數(shù)增生期 這是細胞增值最旺盛的階段 細胞分裂相增多 指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志 一般以細胞分裂指數(shù)表示 即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù) 一般細胞的分裂指數(shù)介于0 1 0 5 初代細胞分裂指數(shù)低 連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3 5 48 特點 是細胞增生最活躍 活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長 細胞群體均一是理想的實驗用細胞 接觸抑制密度抑制 49 3 停滯期 細胞數(shù)量達飽和密度后 細胞遂停止增殖 進入停滯期 此時細胞數(shù)量不再增加 故也稱平臺期 Plateau 停滯期細胞雖不增殖 但仍有代謝活動 繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡 代謝產(chǎn)物積累 pH降低 此時需做分離培養(yǎng)即傳代 否則細胞會中毒 發(fā)生形態(tài)改變 重則從底物脫落死亡 50 特點 1 細胞數(shù)量 細胞達飽和密度 出現(xiàn)密度抑制 2 細胞活動小 3 生長組分下降 4 及時傳代 細胞已中毒 即使傳代 也會影響下一代細胞的功能狀況 51 潛伏期 指數(shù)生長期 停滯期 52 細胞計數(shù)及活力測定 培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好 所以要進行細胞計數(shù) 結果以每毫升細胞數(shù)表示 在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞 總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力 由組織中分離細胞一般也要檢查活力 以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用 復蘇后的細胞也要檢查活力 了解凍存和復蘇的效果 53 細胞計數(shù)原理 54 細胞計數(shù)操作步驟 1 將血球計數(shù)板及蓋片擦試干凈 并將蓋片蓋在計數(shù)板上 2 將細胞懸液吸出少許 滴加在蓋片邊緣 使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間 3 靜置3分鐘 4 鏡下觀察 計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù) 壓線細胞只計左側和上方的 然后按下式計算 細胞數(shù) ml 4大格細胞總數(shù) 4 10000注意 鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團 應按單個細胞計算 若細胞團占10 以上 說明分散不好 需重新制備細胞懸液 55 請計算一下 細胞毒實驗需要效應細胞與靶細胞的比例為20 1且靶細胞需要1x104 TEST 現(xiàn)有效應細胞10ml 取100ul效應細胞加入900ulPBS中 混勻后記數(shù) 細胞濃度為2x104 ml 靶細胞也有10ml 經(jīng)記數(shù) 細胞濃度為1x105 ml 效應細胞共有多少 靶細胞共有多少 以現(xiàn)有的細胞做實驗 能做幾個TEST 56 細胞活力測定步驟 1 將細胞懸液以0 5ml加入試管中 2 加入0 5ml0 4 臺盼蘭染液 染色2一3分鐘 3 吸取少許懸液涂于載玻片上 加上蓋片 4 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù) 計細胞活力 死細胞能被臺盼蘭染上色 鏡下可見深蘭色的細胞 活細胞不被染色 鏡下呈無色透明狀 活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行 但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用 57 哺乳動物細胞冷凍保存 主要目的 1 保存種子細胞 以便隨時取用 2 降低人力和物力 3 減少細胞被微生物污染的危險性 4 避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉變 5 減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變 58 冷凍保存要點 1 冷凍過程要緩慢 有條件的地方 可用程控降溫儀 按每分鐘 1到 3 速度降溫 一直到 80 以下 然后直接放入液氮中長期保存 2 凍存細胞必須處在對數(shù)生長期 活力大于90 無微生物污染 3 細胞濃度控制在 1 106 1 107 ml 4 使用高濃度血清 30 5 使用合適的細胞冷凍保護劑 DMSO 甘油 細胞冷凍保存液主要成分 冷凍保護劑 5 10 培養(yǎng)基 60 血清 30 59 細胞凍存實用程序 收集細胞凍存液重懸分裝入凍存管106 107 mL4 40min 20 30 60min 30 30min 80 過夜液氮罐保存并記錄 60 冷凍保存細胞的解凍與復蘇 1 快速解凍 2 解凍操作過程動作要輕特別注意 解凍時務必注意安全 預防冷凍管爆裂 要帶手套 用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出 放入37 水浴中 切不可直接用手 以免凍傷冷凍管在水浴中解凍時 液面不可超過凍存管蓋面 否則 易發(fā)生污染 61 解凍冷凍保存細胞的離心方法 從液氮中取出凍存的細胞 立即放入37 水浴中快速解凍 將1 2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中 輕輕混勻 用80g離心2 3分鐘 800 1000rpm5min 棄上清液 用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團 并計數(shù)細胞 接種細胞到培養(yǎng)瓶中 起始密度不低于3 105 ml 24 48h后換液 62 1 4體外培養(yǎng)細胞的種類 細胞系細胞株二倍體細胞遺傳缺陷細胞腫瘤細胞 63 一 細胞系初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞 即稱之為細胞系 如細胞系的生存期有限 則稱之為有限細胞系已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系 稱連續(xù)細胞系或無限細胞系 64 二 細胞株從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法 由單細胞增殖形成的細胞群 稱細胞株 再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群 亦可稱之為亞株 65 三 二倍體細胞細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同 2n細胞占75 或80 以上 的細胞群 稱二倍體細胞 如僅數(shù)目相同 而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體 為保持二倍體細胞能長期被利用 一般在初代或2 5代即大量凍存作為原種 66 四 遺傳缺陷細胞從有先天遺傳缺陷者取材 主要為成纖維細胞 培養(yǎng)的細胞 或用人工方法誘發(fā)突變的細胞 都屬遺傳缺欠細胞 這類細胞可能具有二倍體核型 也可呈異倍體 67 五 腫瘤細胞系或株這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類 我國已建細胞系主要為這類細胞 腫瘤細胞系多由癌瘤建成 多呈類上皮型細胞 常已傳幾十代或百代以上 并具有不死性和異體接種致瘤性 68 細胞系或細胞株的命名 HeLa 為供體患者的姓名 來源于宮頸癌 CHO 中國地鼠卵巢細胞 ChineseHamsterOvary 宮 743 宮頸癌上皮細胞 1974年3月建立NIH3T3 美國國立衛(wèi)生研究院 NationalInstituteofHealth 建立 每3天傳代 每次接種3 105細胞 毫升 69 細胞系或株的鑒定 管理和使用 ATCC入庫細胞要求檢測項目如下 http www atcc org培養(yǎng)簡歷 組織來源日期 物種 組織起源 性別 年齡 供體正常或異常健康狀態(tài) 細胞已傳代數(shù)等凍存液 培養(yǎng)基和防凍液名稱細胞活力 融解前后細胞接種存活率和生長特性培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱 一般要求不含抗生素 血清來源和含量 70 細胞形態(tài) 類型 如為上皮或成纖維細胞等 融解后細胞生長特性核型 二倍體或多倍體 標記染色體的有無無污染檢測 包括細菌 真菌 支原體 原蟲和病毒等物種檢測 檢測同工酶 以證明細胞有否交叉污染以及反轉錄酶檢測免疫檢測 一兩種血清學檢測細胞建立者 建立者姓名 檢測者姓名 71 72 73 74 75 細胞凋亡 細胞凋亡 是能量依賴的細胞內(nèi)死亡程序活化而致的細胞自殺 由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程 細胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD 指生理性細胞死亡 描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的 并受到嚴格程序控制的正常組成部分 76 細胞凋亡與壞死的區(qū)別 壞死凋亡 1 性質(zhì)病理性 非特異性 非遺傳性生理性或病理性 特異性遺傳性2 誘導因素強烈刺激 極端環(huán)境 隨機發(fā)生較弱刺激 非隨機發(fā)生3 生化特點被動過程 無新蛋白合成 主動過程 有新蛋白合成 不耗能耗能4 形態(tài)變化細胞結構全面溶解 破壞 胞膜及細胞器相對完整細胞腫脹細胞皺縮 核固縮5 DNA電泳彌散性降解 電泳呈均一DNA片段化 180 200bp DNA片狀電泳呈 梯 狀條帶6 炎癥反應溶酶體破裂 局部炎癥反應溶酶體相對完整 局部無炎癥反應7 凋亡小體無有8 基因調(diào)控無有 77 78 常用細胞凋亡檢測方法 細胞凋亡的形態(tài)學檢測磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 線粒體膜勢能的檢測DNA片斷化檢測TUNEL法Caspase 3活性的檢測凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析 79 細胞凋亡的形態(tài)學檢測 80 磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于細胞膜的內(nèi)側 但在細胞凋亡的早期 PS可從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面 暴露在細胞外環(huán)境中 Annexin V是一種分子量為35 36KD的Ca2 依賴性磷脂結合蛋白 能與PS高親和力特異性結合 碘化丙啶 propidineiodide PI 是一種核酸染料 它不能透過完整的細胞膜 但在凋亡中晚期的細胞和死細胞 PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染 因此將Annexin V與PI匹配使用 就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來 81 AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium 82 83 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用 多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡 而線粒體跨膜電位的下降 被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件 它發(fā)生在細胞核凋亡特征 染色質(zhì)濃縮 DNA斷裂 出現(xiàn)之前 一旦線粒體跨膜電位崩潰 則細胞凋亡不可逆轉 線粒體跨膜電位的存在 使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質(zhì) 其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低 84 DNA片斷化檢測 細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成50 300kbp長的DNA大片段 或180 200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 DNAladder 85 TUNEL法 細胞凋亡中 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3 OH末端 可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶 TdT 的作用下 將脫氧核糖核苷酸和熒光素 過氧化物酶 堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3 末端 從而可進行凋亡細胞的檢測 這類方法稱為脫氧核