分子生物學 第三章 DNA的復制和修復ppt精選課件

.,第三章DNA的復制,DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。,.,DNA通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學的中心法則。,.,在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過復制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了中心法則的內(nèi)容。,.,DNAdependentDNApolymeraseDDDPDNAdependentRNApolymeraseDDRPRNAdependentRNApolymeraseRDRPRNAdependentDNApolymeraseRDDP,.,.,第一節(jié)DNA復制概況,一.DNA復制的半保留性DNA在復制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復制(semi-conservativereplication)。,.,DNA以半保留方式進行復制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實驗所證明。該實驗首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：,.,二.復制子（replicon),復制子:基因組中能單獨進行復制的單位。每個起始點到終止點的區(qū)域為一個復制子。,.,1.起始點（originofreplication,ori),原核生物DNA分子中只有一個起始點，長度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個復制起始點。,.,.,E.coli中的Ori區(qū)富含AT和回文對稱的序列。這種特殊的結(jié)構(gòu)與復制起點易于解鏈以發(fā)動DNA復制（形成“呼吸現(xiàn)象”）和促進聚合酶與DNA結(jié)合的功能高度統(tǒng)一。,.,isolationofori,.,.,大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列,.,2.終點（ter）,對E.coliDNA復制過程的研究發(fā)現(xiàn)，其兩個復制叉總是在一個固定的位點相遇，這個特殊的位點包含兩個分別由3個終止子（terminus）組成的終止區(qū)域terE，terD，terA和terF，terC，terB，其中每個終止子含有相對保守的22bp序列（有說23bp共有序列？），分別負責對不同區(qū)域的復制叉行使終止功能。,.,目前已經(jīng)分離出相對分子質(zhì)量為3.6103的終止蛋白Tus（terminusutilizationsubstance）。這種終止蛋白能識別ter序列，形成terTus復合體，以防止DNA過度復制，避免出現(xiàn)DNA多聚體。,.,為了保證DNA復制的完整性，每一個復制叉必須穿過另一復制叉的終止區(qū)才能到達自身終止區(qū)，并可以在其中3個位點的任一個位點發(fā)生終止。如果兩個復制叉的延伸速度不一致，或因某種原因一個復制叉的延伸過程被拖延，先期到達終止子的復制叉會停留等待另一復制叉的經(jīng)過，共同完成全基因組的復制過程。,.,三.復制的方向性,復制的方向：單向或雙向,.,.,.,雙向復制DNA復制時，以復制起始點為中心，向兩個方向進行復制。但在低等生物中，也可進行單向復制（如滾環(huán)復制）。,.,.,.,.,四.引物RNADNA復制的起始必須先期合成一段引物分子。研究表明無論是原核生物還是真核生物，大多數(shù)引物復制是一段長度不等的，一般為10個核苷酸左右的RNA分子。（有說為110個核苷酸？）,.,所有DNA聚合酶具有一個共同的特點均不能自主地發(fā)動DNA的復制，只能利用已提供的核苷酸3OH末端聚合dNMP，合成DNA鏈。它們必須以一段具有3端自由羥基（3-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。引物RNA的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。,.,五.DNA的半不連續(xù)復制由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為35。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。,.,以35方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復制時基本上是連續(xù)進行的，其子代鏈的聚合方向為53，這一條鏈被稱為前導鏈(leadingstrand)。而以53方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是53，這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。,.,由于親代DNA雙鏈在復制時是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復制時，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為10002000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。,.,第二節(jié)參與DNA復制的酶、相關(guān)蛋白及酶學機制,在細胞中，雙螺旋DNA復制是DNA聚合酶催化的酶促反應過程。但DNA聚合酶只能延長已有的DNA或RNA引物鏈，不能從頭起始DNA鏈的合成,.,另外，在DNA復制中形成特殊的復制叉（或生長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，DNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋DNA解旋（unwinding），并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成DNA聚合酶不能完成這一過程,.,在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段（Okazakifragment）的連接也是DNA聚合酶無法完成的。實際上，在復制叉處進行復雜的DNA復制過程中，需要許多相關(guān)的酶和蛋白因子參與。,.,除DNA聚合酶外，還包括：DNA旋轉(zhuǎn)酶；使DNA雙股鏈在復制叉解開的解旋酶；在DNA復制前防止解開的DNA單鏈局部退火的DNA結(jié)合蛋白；合成RNA引物的酶；除去RNA引物的酶；使岡崎片段共價連接的DNA連接酶等重要的酶與蛋白因子。,.,DNA聚合酶、引物的引發(fā)酶、DNA解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、連接酶等在內(nèi)的如此眾多的酶分子均集中在復制交叉處組成一個復合體協(xié)同互作，共同完成DNA分子的復制過程，這種復合體也稱為DNA復制體（replisome）。,.,一.DNA聚合酶,（一）原核生物DNA聚合酶種類在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)有五種:DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）,.,前三種酶（DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。DNA聚合酶催化DNA新鏈中脫氧核苷酸之間的聚合反應的酶。參與DNA復制的主要是pol和pol。,.,.DNA聚合酶I,1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNA聚合酶I。大腸桿菌K-12株的DNA聚合酶I由基因polA編碼，由928個氨基酸組成，分子量103.1kDa，結(jié)構(gòu)類似球狀，直徑約650nm，每個細胞約有400個分子。,.,此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。,.,1）聚合作用：53；2）35外切酶活性：校對（或正）功能；3）53外切酶活性：引物切除、損傷修復，主要功能是切除引物、填補岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復；,.,.,.,如果新鏈合成過程中出現(xiàn)錯配，新添加的核苷酸因為與模板不能正確配對，將形成單鏈尾巴，此單鏈末端可被DNA聚合酶識別，并以3-5外切酶活性切除此核苷酸，再用其聚合酶活性配對正確的核苷酸，此功能被稱為校讀功能。,.,DNApol是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主。用特異的蛋白酶（如枯草桿菌蛋白酶）處理，可把DNApol水解為兩個片段，即在F，G螺旋之間發(fā)生斷裂。,.,小片段，具有323個氨基酸殘基，小片段的分子量為35KD，具有53外切酶活性。可以逐個切除處于配對狀態(tài)的具5磷酸末端的核苷酸，一次最多可以切除10個核苷酸。,.,大片段或稱Klenow片段，具有604個氨基酸殘基，分子量為68KD，具有DNA聚合酶活性和35外切酶活性；53聚合酶活性使Klenow片段可以3OH末端添加新的核苷酸延長已存在的多核苷酸鏈。,.,3-5外切酶活性則令Klenow片段可以從DNA的3端，即新鏈生長端開始逐個切除核苷酸。此活性傾向于切除DNA合成中的末端錯配堿基。,.,以上三重活性相結(jié)合，使DNA聚合酶I適用于取出起始DNA合成所需的RNA引物，并填充去除引物后DNA雙鏈中出現(xiàn)的短單鏈區(qū)域。,.,類似的短單鏈區(qū)域也可出現(xiàn)在DNA損傷修復過程中切除錯誤堿基后，故DNA聚合酶I也可用于損傷DNA的修復。但DNA聚合酶I的延伸能力不強，與模板接合一次只能使核苷酸鏈延長20-100個核苷酸，在新鏈的延長反應中不可能起主要作用。,.,pol為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個片段，其中的大片段稱為Klenowfragment，具有53聚合酶活性和35外切酶的活性。,.,.,.,2.DNA聚合酶II,DNA聚合酶II具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。,.,3.DNA聚合酶III,該酶由10個亞基組成，分別為、及。DNA聚合酶具很強的延伸能力，能在新鏈上每分鐘添加105個核苷酸。它是原核生物體內(nèi)真正起復制作用的酶。,.,亞基：53聚合酶活性；亞基：35外切酶,校對和編輯；為裝配必須；以上三者構(gòu)成核心酶。,.,DNA聚合酶為不對稱異源二聚體,每個DNA聚合酶含有二個拷貝的核心酶，另外有二個拷貝的二聚化亞基連接這二個核心酶；二個拷貝的亞基負責保持核心酶與模板鏈的結(jié)合并使酶能夠沿模板鏈移動；另外五種亞基組成復合體，可促進全酶組裝并使亞基結(jié)合到DNA上。,.,大腸桿菌DNA聚合酶,.,pol由十種亞基組成，其中亞基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有復制DNA的功能；而亞基具有35外切酶的活性，因而與DNA復制的校正功能有關(guān)。,.,大腸桿菌DNA聚合酶全酶的結(jié)構(gòu)和功能,延長因子,DNA聚合酶異二聚體,核心酶,校對,引物的結(jié)合和識別,促使核心酶二聚化,.,前導鏈與后隨鏈復制的方向不同,位于前導鏈DNA延伸點的復制體在完成一個岡崎片段的復制后必須解體，或以復制體整體方式才岡崎片段的末端解離后又迅速“調(diào)轉(zhuǎn)車頭”結(jié)合到新的起點合成岡崎片段。在大腸桿菌中完成一次基因組復制，復制體需要啟動20004000次的岡崎片段的復制。,.,顯然這種模式是不符合生物進化的“經(jīng)濟原則”的。隨后的研究證明每一個復制叉均含有一個DNA聚合酶的二聚體，它可以同時催化前導鏈和后隨鏈的同時復制?；谶@一科學發(fā)現(xiàn)，人們提出了在雙鏈DNA復制進程中“回環(huán)模型”。,.,回環(huán)模型,即在復制叉處僅有一個大型的DNA復制體，后隨鏈的一個岡崎片段模板DNA以倒退的方式從DNA聚合酶中將模板DNA釋放出來，新岡崎片段的DNA單鏈與前導鏈一樣，以相同的方向完成復制。以滾環(huán)模式擴增DNA的生物在復制叉處也是按回環(huán)模型完成DNA復制的。,.,.,聚合酶III核心酶,大腸桿菌復制體結(jié)構(gòu)示意圖,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滯后鏈,前導鏈,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引發(fā)體,拓撲異構(gòu)酶II,-夾子,-聚體,-夾子,-復合物,RNA引物,單鏈結(jié)合蛋白（SSB）,.,復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型,.,.,主要是對DNA損傷的修復；以及在DNA復制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。,修復紫外光引起的DNA損傷,DNA復制的主要聚合酶，還具有3-5外切酶的校對功能，提高DNA復制的保真性,原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）,.,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位點,3,3,5,5,錯配堿基,.,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位點,單鏈缺口,5,.,DNA聚合酶和是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯誤傾向修復(errorpronerepair)。當DNA受到較嚴重損傷時，即可誘導產(chǎn)生這兩個酶，使修復缺乏準確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會殺死許多細胞，但至少可以克服復制障礙，使少數(shù)突變的細胞得以存活。,.,（二）真核生物中的DNA聚合酶,在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）。,.,其中，參與染色體DNA復制的是pol（延長滯后鏈）和pol（延長前導鏈），參與線粒體DNA復制的是pol，pol與DNA損傷修復、校讀和填補缺口有關(guān)，pol只在其他聚合酶無活性時才發(fā)揮作用。,.,其他學者的意見：真核生物DNA聚合酶,、及四種，都有53聚合功能。及參與核DNA復制；：鏈合成的引發(fā)，：鏈的延長pol；切除引物后填補空隙：外切核酸酶：線粒體DNA復制,.,定位細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核3-5外切-+酶活性功能,引物合成,修復作用,線粒體DNA的復制,核DNA的復制,？,真核生物中的DNA聚合酶,.,至今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都不能從頭合成多核苷酸鏈，而只能通過從3OH末端添加新的核苷酸延長已存在的多核苷酸鏈。此特性決定了復制中新鏈的合成方向。,.,（三）DNA復制的保真性（即忠實性）為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復制必須具有高保真性。DNA復制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：1遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2DNA聚合酶在復制時對堿基的正確選擇；3對復制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進行校正。合成時以RNA為引物,.,DNA聚合酶的校對功能,.,DNA聚合酶的校對功能,聚合酶,錯配鹼基,復制方向,正確核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除錯配核苷酸,.,DNA復制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？,這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對復制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復制的忠實性。,.,二.DNA旋轉(zhuǎn)酶與DNA超螺旋的松馳,天然DNA的負超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復制的進行，復制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復制中需要DNA旋轉(zhuǎn)酶去除解螺旋酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。,.,大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）又稱拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase），由四個亞基組成四聚體22真核的呈二聚體。DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用機制如圖5-6所示。,.,圖5-6DNA旋轉(zhuǎn)酶引入超螺旋的分子模型：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上；：DNA雙鏈被切斷，兩個亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動，張開其靠近DNA斷裂點的部分；：未斷的DNA雙鏈穿過切口；：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上；：連接好的DNA釋放出來。,.,：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上；：DNA雙鏈被切斷，兩個亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動，張開其靠近DNA斷裂點的部分；：未斷的DNA雙鏈穿過切口；：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上；：連接好的DNA釋放出來。,.,DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個負超螺旋，因此可以消除復制叉向前移動所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復制完的兩個子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉(zhuǎn)酶的催化功能。當加入DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等時均能抑制細菌DNA的合成?？梢奃NA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復制所必不可少的。,.,拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)拓撲異構(gòu)酶可使DNA雙鏈中的一條鏈切斷，松開雙螺旋后再將DNA鏈連接起來，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。拓撲異構(gòu)酶可切斷DNA雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，再將其連接起來。,大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu),.,DNA拓撲異構(gòu)酶(DNATopisomerase)：拓撲異構(gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白拓撲異構(gòu)酶：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶,.,DNA旋轉(zhuǎn)酶對真核細胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開纏繞，在任何細胞周期中姐妹染色體都將無法分離。此外，DNA旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。,.,三.DNA解旋酶,復制過程中，復制叉在不斷前進，復制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復制能夠順利進行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔上述任務是DNA解旋酶（DNAhelicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）。,.,DNA解旋酶是很多細胞過程所要求的（如核苷酸切除修復、同源重組、轉(zhuǎn)錄終止）。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱（又稱解鏈酶）。原核生物大腸桿菌為DnaB和Rep蛋白，DnaB結(jié)合于滯后鏈模板沿53方向前進，Rep蛋白結(jié)合于前導鏈模板沿35方向移動（圖5-7）。,.,8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿35移動，而解螺旋酶I、II、III沿53移動。,.,DNA解鏈酶解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解鏈酶。,.,真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen,T-ag）具解開雙鏈的功能。此外也在一些真核生物中分離純化出多種DNA解旋酶，其功能還在鑒定證實中。,.,圖5-7DNA雙螺旋的解旋,.,四.單鏈結(jié)合蛋白,單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。在細胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能（如同源重組）。其作用為：使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代DNA；保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。,.,在復制中，這包括穩(wěn)定熔解起點，維持解旋酶活性，從DNA模板上去除二級結(jié)構(gòu)以及抑制核酸酶活性。即SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展狀態(tài)，以保證復制順利進行。在E.coli中SSB為四聚體，對單鏈DNA有很高的親和性，但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。,.,它們與DNA結(jié)合時有協(xié)同作用，即有一個SSB與DNA結(jié)合時，就會有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴展分布整個DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。SSB有某些堿基組成的傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復始地循環(huán)使用，在DNA的修復和重組中都有SSB的參與。,.,單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代DNA；保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。,.,五.引發(fā)酶與引物RNA的合成,已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為110個核苷酸（表5-3）。,.,表5-3DNA復制中滯后鏈前體片斷的RNA引物,.,DNA復制中以RNA作引物的實驗證據(jù)是噬菌體M13的DNA復制對轉(zhuǎn)錄抑制劑的敏感性實驗提供的，其結(jié)果指出RNA可能提供了DNA復制的3端。此外，Reiji等設(shè)計的實驗也證明RNA引物是DNA復制必須的,.,Reiji等設(shè)計的實驗,即利用含甲苯的緩沖液處理大腸桿菌以提高該菌對外源核苷酸的通透性，然后再以大腸桿菌與-32P脫氧核苷三磷酸（dNTP）和未標記的核糖核苷三磷酸（NTP）的混合物保溫，最后從大腸桿菌分離DNA和用稀堿處理。堿性水解發(fā)生在3,5-磷酸二酯鍵的磷酸基與C-5間，這樣就使dNTP的放射性磷轉(zhuǎn)移到核糖核苷酸上去（圖5-8）。,.,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每一岡崎片段都產(chǎn)生一個RNA-DNA接頭，說明DNA的復制是以RNA為引物。,圖5-8RNA引物存在的實驗證明,.,催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶與負責RNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是完全不同的兩種酶類。,.,引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們在合成以后并不與模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。在轉(zhuǎn)錄的過程中，RNA分子是RNA聚合酶作用下的產(chǎn)物，合成出的RNA分子會與模板DNA鏈分離。在E.coli中合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶由dnaG基因編碼，這種RNA聚合酶也稱為引發(fā)酶（primase）。,.,E.coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，分子量為60000，每個細胞中有50100個分子。該酶單獨存在時是相當不活潑的，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)相互結(jié)合成為一個復合體時才有活性。這種復合體就稱為引發(fā)體（primasome）。引物分子為DNA聚合酶合成DNA分子提供了啟動聚合的3OH末端。,.,機體選擇RNA作為引物，其原因可能在于減少致死突變（lethalmutation）。DNA復制中，從模板拷貝最初的幾個核苷酸時，由于堿基堆集力很弱，其氫鍵結(jié)合能力也很弱，因而堿基對的錯配幾率就大很多，加上這幾個核苷酸還沒有與模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶35校對功能很難發(fā)揮作用。,.,因此為了保證生物DNA復制的保真度，采用以RNA為引物這種過渡形式，既為DNA聚合酶提供3-羥基端，又容易被DNA聚合酶識別而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶進行切口平移。切口平移過程中發(fā)生錯誤的幾率極少，因為DNA聚合酶（polI）有35外切核酸酶活性，具有校對功能。,.,無論是前導鏈還是后隨鏈的引物均為RNA分子，當DNA復制完成后，必須將RNA引物分子降解。研究證明，相對分子質(zhì)量為103103的DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后，C端形成相對分子質(zhì)量為68103的大片段，N端形成相對分子質(zhì)量為35103的小片段，大片段具有從5向3方向的聚合DNA功能和從3向5的外切校正功能，但效率較低，也稱klenow片段。小片段具有從5向3方向的外切核酸酶功能。,.,六.DNA連接酶,DNA連接酶(DNAligase)，1967年發(fā)現(xiàn)若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用,.,DNA連接酶催化的條件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,.,DNA連接酶連接切口,Mg2+,連接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板鏈,模板鏈,.,第三節(jié)DNA復制過程的總結(jié)及其調(diào)控,DNA復制通常是從雙螺旋的特定位置復制原點（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequentlyopeningregion）,.,.,由此產(chǎn)生的瞬時單鏈與SSB蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）結(jié)合，對復制的起始十分重要。原核生物的復制原點通常為一個，而真核生物則有多個特定的復制原點。,.,依DNA合成的起始方式，復制可分為從新起始與共價延伸兩種類型前者是前導鏈從新開始，也叫復制叉式復制；后者是先導鏈共價結(jié)合在一條親代鏈上，也叫滾環(huán)式復制。,.,復制主要以雙向等速進行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復制；部分是單方向進行，如質(zhì)粒ColE1的復制；或以不對稱的雙向方式進行，如線粒體DNA的復制。,.,一.復制的起始,DNA復制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。1.預引發(fā)（1）解旋解鏈，形成復制叉由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。,.,單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。DNA復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復制叉。對于雙向復制而言，形成的兩個復制叉向相反方向行進，每個復制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。,.,圖5-12復制叉（箭頭表示子鏈總的生長方向）,.,（2）引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識別復制起始點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。2.引發(fā)在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3端自由羥基（3-OH）。,.,DNA半不連續(xù)復制的模式說明，雙鏈DNA分子復制起始時從復制原點處DNA分子解鏈，前導鏈在一段RNA引物的發(fā)動下連續(xù)合成的模式完成合成過程，而后隨鏈是按不連續(xù)合成的模式不斷地完成岡崎片段的合成，而每個岡崎片段都需要有RNA引物的發(fā)動過程。,.,RNA聚合酶抑制劑利福平對DNA復制的起始也具有明顯抑制效應。但一旦復制的起始過程完成后，利福平的抑制效應也隨之消失，表明前導鏈的RNA引物是由RNA聚合酶合成的。如同基因轉(zhuǎn)錄過程一樣，此RNA聚合酶可以使雙鏈DNA分子局部開鏈。,.,RNA聚合酶在合成1012個核苷酸RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前導鏈DNA合成；在完成10002000個核苷酸的DNA合成后，后隨鏈才在引發(fā)酶的作用下開始岡崎片段的引物RNA的合成。這一過程也稱為DNA復制的轉(zhuǎn)錄激活。,.,二復制的延長1.聚合子代DNA由DNA聚合酶催化，以35方向的親代DNA鏈為模板，從53方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復制延長的是DNA聚合酶；在真核生物中，是DNA聚合酶(延長滯后鏈)和（延長前導鏈）。,.,.,2.引發(fā)體移動引發(fā)體向前移動，解開新的局部雙螺旋，形成新的復制叉，滯后鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進行鏈的延長。,.,.,三復制的終止1.去除引物，填補缺口在原核生物中，由DNA聚合酶來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。,.,2.連接岡崎片段在DNA連接酶的催化下，形成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。,.,大腸桿菌染色體復制的終止,ori,復制叉2,復制叉1,終止復制叉2,終止復制叉1,復制叉1,復制叉2,完成復制,DNA拓撲異構(gòu)酶,連鎖染色體,.,四染色體多復制子復制的非一致性,原核生物在染色體DNA復制完成之前，復制起始點可以連續(xù)發(fā)動新一輪的復制起始，表現(xiàn)為多個復制叉的特點。,.,而真核生物染色體DNA雖多為多復制子，但每一個復制子在一個細胞周期中只啟動一次，對每一個復制子來說，無論復制完成得早晚，都必須等待到下一個細胞周期開始后才有可能發(fā)動新一輪復制。,.,成千上萬個獨立的復制子看似在“同一起跑線上”，其實每個復制子發(fā)動復制的先后時序有很大的差別。而且這種時序的差別明顯地表現(xiàn)在同一染色體的不同復制子之間，表現(xiàn)在不同類型的細胞之間。,.,將啤酒酵母中克隆到的復制起點序列（ori）構(gòu)建成一個環(huán)狀的DNA分子，再導入到酵母細胞中，發(fā)現(xiàn)它可以啟動環(huán)狀的DNA分子自主復制，將這段富含AT堿基并在不同復制子中較為保守的序列稱為自主復制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）。,.,果蠅受精后可檢測處于開放狀態(tài)的ARS從5000個上升到50000個，發(fā)育早起的復制子的長度僅有7.9kb，而發(fā)育到成蟲時復制子的長度可以增加到40kb，可見此時許多ARS已處于關(guān)閉狀態(tài)。,.,盡管這種調(diào)控的機制目前還不甚了解，但復制子變化規(guī)律表明，復制子的多少與DNA復制的速度有關(guān)，而完成全基因組的復制與細胞、組織及發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，表現(xiàn)了多復制子復制啟動的非一致性。,.,五DNA復制的調(diào)控,與基因表達調(diào)控一樣，DNA復制調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是起始過程的轉(zhuǎn)錄激活效率，同時細菌的培養(yǎng)試驗表明，細菌的繁殖速率與營養(yǎng)條件（特別是氨基酸饑餓狀態(tài)對復制的影響），及多種專一性蛋白因子的濃度密切相關(guān)。,.,細菌的嚴謹型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒，相容性質(zhì)粒和不相容性質(zhì)粒之間的差異都表現(xiàn)在復制起始調(diào)控上，這種調(diào)控機制是自然選擇中的先后適應。對原核生物DNA復制調(diào)控研究最為詳盡的是ColE質(zhì)粒。,.,位于復制起始原點ori上游555nt處有RNA轉(zhuǎn)錄起點，朝向ori方向轉(zhuǎn)錄RNA。當轉(zhuǎn)錄通過原點ori后RNA被NaseH酶切，產(chǎn)生的3OH為DNA聚合酶提供引物，發(fā)動DNA復制，從某種意義上講RNA的轉(zhuǎn)錄對DNA復制是一種正控制的激活過程。,.,但與此同時，在原點ori上游445nt處的另一極性單鏈上還有一個轉(zhuǎn)錄起點，背向ori方向轉(zhuǎn)錄RNA，并與RNA分子之間有110nt的互補序列。實際上RNA作為RNA的反義RNA，以負控制的方式參與DNA復制的調(diào)控。,.,RNA/RNA配對成雙鏈后形成3個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而阻止了NaseH對RNA的酶切，在ori區(qū)域不能形成DNA聚合酶的引物，復制過程被抑制。RNA和RNA分子的轉(zhuǎn)錄啟動又受到Rop基因的負控制調(diào)節(jié)。,.,當RNA的轉(zhuǎn)錄到達ori原點下游不遠的地方時，使編碼63個氨基酸的Rom蛋白基因表達，Rom蛋白在RNA存在的情況下，可限制RNA只轉(zhuǎn)錄到達100200nt將行終止，不能到達ori原點，也不能產(chǎn)生DNA聚合酶的引物。當RNA的轉(zhuǎn)錄到達200360nt以后，Rom蛋白又會促進RNA與RNA互補形成雙鏈。,.,但當RNA超過360nt以后，雖然RNA和RNA之間也可形成雙鏈，但此時的雙鏈二級結(jié)構(gòu)并不影響NaseH對RNA的酶切和引物的形成。由此可見，Rom蛋白對復制調(diào)控是通過RNA/RNA形成特異二級結(jié)構(gòu)而體現(xiàn)的，而且這種調(diào)控也只是在RNA轉(zhuǎn)錄的特定時刻才具有效應。,.,第四節(jié)線性DNA復制避免5端短縮的機制,一、T7噬菌體方式共聯(lián)體假說1972年J.D.Watson根據(jù)從被感染的菌體中分離得到T7噬菌體的串聯(lián)體（concatemer），最終提出線性DNA避免5端短縮的共聯(lián)體假說。這一假說認為在線狀DNA分子在5末端的單鏈缺口處互補，形成共聯(lián)體?，F(xiàn)已證明T7噬菌體全基因組有39936bp，在編碼的41個基因中，已鑒定了的34個基因產(chǎn)物，確定了26個基因的功能。,.,復制起點位于距離端點17%處。在線狀DNA分子的兩端具有同源性很高的167bp的正向重復序列（豐足末端），其中有一個RNase切點。,.,當兩條子代DNA合成出后，隨即在被切除引物RNA的缺口處互補配對形成雙鏈，RNase在切點處進行錯位酶切產(chǎn)生3OH并游離處部分單鏈模板。DNA聚合酶即可利用3OH末端缺口的補齊。,.,二、腺病毒2方式,腺病毒2（adenovirus2）是一種較大的線狀DNA病毒，其基因組全長為35937bp，線狀DNA分子兩端具有103106bp，富含AT并且第一個核苷酸對為C/G的反向重復序列（），其中包含50bp的復制起點。DNA的復制按單鏈置換式（standdisplacement）分別先后從兩個末端起始。,.,一種相對分子質(zhì)量為8.0104的末端結(jié)合前體蛋白（preterminalprotein，pTP）被剪接為成熟的相對分子質(zhì)量為5.0104的末端結(jié)合蛋白（TP）后，與單鏈結(jié)合蛋白（SSB）一起結(jié)合病毒DNA的3末端。,.,在完成一條子代DNA分子復制后，被置換的另一條DNA分子以其IR序列配對形成“鍋柄式”（panhandle）的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，鍋柄處的部分雙鏈結(jié)構(gòu)在TP，pTPSerdGMP等因子的作用下按同樣的方式完成DNA的復制。,.,腺病毒按這種方式構(gòu)成復制起始復合體中不需要引發(fā)酶合成的RNA引物，從而避免了5末端切除引物分子后形成5端短縮形象。,.,三、痘病毒方式,痘病毒（poxvirus）雙鏈DNA分子的兩端具有閉合的環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA復制從中部原點起始，雙方向展開，使末端發(fā)夾部分轉(zhuǎn)換為雙鏈，并使兩條雙鏈DNA分子連接成類似于雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的共聯(lián)體。,.,核酸酶從雙鏈分子內(nèi)部進行錯切，共聯(lián)體解體，游離出包含有末端反向重復序列的單鏈，末端自行折疊，連接成兩條雙鏈痘病毒DNA分子。,.,四、微小病毒方式,微小病毒（parvovirus）是嚙齒動物的單鏈線狀DNA病毒，基因組大小為4800bp，具有重疊基因但只編碼3個蛋白質(zhì)。雖然微小病毒DNA的復制全部利用宿主的所有酶系統(tǒng)并與寄主同步，但微小病毒單鏈線狀DNA的兩端結(jié)構(gòu)的特異性決定了其在避免5端短縮機制上的特殊模式。,.,在微小病毒單鏈線狀DNA的兩端各自一段序列不同的反向重復序列，這一結(jié)構(gòu)導致5和3端折疊，各自形成一段短的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。復制啟動時，DNA聚合酶可直接利用3OH，以單鏈DNA分子為模板，合成出一條完整的雙鏈發(fā)卡分子。,.,核酸酶進而在模板鏈中的反向重復序列處切割，DNA聚合酶再行利用暴露的3OH，以游離出包含反向重復序列5末端為模板，合成出一條完整的雙鏈DNA分子，兩端的反向重復序列可再次形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，啟動新一輪的DNA復制。,.,五、真核生物方式端粒的形成與端粒酶(telomerase),端粒（telomere）:真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復序列構(gòu)成，可重復數(shù)十次至數(shù)百次。這些重復序列和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復序列，長度515kb。作用：保護染色體末端免于化學修飾或核酸酶降解；解決染色體復制時末端丟失問題。,.,.,端粒酶（telomerase）,端粒酶（Telomerase）:是一種RNA-蛋白質(zhì)復合體，兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。,初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。,端粒酶,.,1995年，JunliFeng等克隆了人類端粒酶RNA基因，長約450個堿基的RNA序列中有一段長11個核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補。端粒酶蛋白質(zhì)的分離：四膜蟲端粒酶兩個多肽成分p80和p95。,.,端粒酶(telomerase)的作用機制,.,.,.,端粒合成的一種模型,整合和雜交,.,端粒與衰老,實驗：在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時，端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細胞的衰老是由端粒驅(qū)動的。體外培養(yǎng)的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對染色體的保護作用。細胞隨之發(fā)生衰老和死亡。,.,可把端?？闯梢幻骁姡肆５拈L度是鐘上的刻度，記載了細胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時鐘”，可通過測定端粒的長度預測細胞的壽命。胚胎細胞和生殖細胞端粒的長度并不隨細胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。,.,端粒酶與腫瘤,人體內(nèi)除了生殖細胞和少數(shù)一些體細胞如淋巴細胞等細胞外，絕大多數(shù)體細胞中無法檢測到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細胞中能檢測到端粒酶的活性。腫瘤的端粒長度很短，其繼續(xù)縮短導致染色體融合、細胞死亡，而端粒酶的激活可以維持端粒的長度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。,.,端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標?？梢酝ㄟ^各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長，而對正常細胞沒有影響。,.,第五節(jié)基因突變與DNA的損傷和修復,作為一種能決定生命狀態(tài)存在和延續(xù)的生物大分子，DNA在遺傳過程中必需保持高度的精確性和完整性，而且這種性能是細胞中任何一種分子都無法與之相比的。盡管如此，在DNA復制過程中，仍難免會存在少量未被校正的差錯。此外，DNA還會受到各種物理和化學因素的損傷。,.,這些差錯和損傷如果不被修復，將會產(chǎn)生嚴重的細胞學后果，因為DNA分子本身是無法替代的，一個細胞通常只有1-2套基因組DNA，而不像蛋白質(zhì)和RNA分子那樣，能利用DNA中的遺傳信息不斷產(chǎn)生新的分子來替代受損傷的分子。,.,維護DNA遺傳信息的穩(wěn)定性對生物細胞來說是極其重要的。在漫長的生命進化過程中，生物體不僅演化出能糾正復制錯誤的“校正”系統(tǒng)，而且在細胞中形成了多種多樣的DNA修復系統(tǒng)，能對各種DNA的損傷進行修復，恢復DNA正常的超螺旋結(jié)構(gòu)，以保持每個世代遺傳信息的穩(wěn)定性。,.,極少數(shù)不能修復的DNA損傷將會導致基因的突變。突變是遺傳物質(zhì)發(fā)生了可遺傳的改變，而這種改變可以發(fā)生在染色體水平和基因水平上。其中一部分突變將有利于物種的進化，而另一部分突變將導致細胞發(fā)生變異和死亡。,.,一.DNA的損傷,由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)、鏈的斷裂、重組等。引起DNA損傷突變的因素如下,.,（一）自發(fā)因素1脫嘌呤和脫嘧啶在生理條件下，DNA分子通過自發(fā)水解經(jīng)常發(fā)生脫嘧啶和脫嘌呤反應，使嘌呤堿和嘧啶堿從DNA分子的脫氧核糖-磷酸骨架上脫落下來。例如，在腺嘌呤和鳥嘌呤的N-9及脫氧核糖C-1之間的N-糖苷鍵常發(fā)生自發(fā)水解反應而斷裂，從而失去嘌呤堿基，使該嘌呤堿基所編碼的遺傳信息丟失。,.,Lindahl估計，一個哺乳動物細胞在37條件下，20小時內(nèi)通過自發(fā)水解可從DNA鏈上脫落約10000個嘌呤堿和500個嘧啶堿。在一個長壽命的非復制的哺乳動物細胞（如人的神經(jīng)細胞）的整個生活中自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108個嘌呤堿，它們占細胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。每個細胞每小時脫去的嘌呤堿和嘧啶堿分別約為580個和29個。自發(fā)脫嘧啶反應一般頻率很低。,.,2堿基的脫氨基作用堿基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）都含有環(huán)外氨基，氨基有時會自發(fā)脫落，從而使胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ║），腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤（I）,鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤（X）。這些脫氨基產(chǎn)物的配對性質(zhì)與原來的堿基不同，即U與A配對，I和X均與C配對。而且DNA復制時，它們將會在子鏈中產(chǎn)生錯誤而導致DNA損傷。,.,例如，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶后，如果未被修復，產(chǎn)生的尿嘧啶會在接下來的復制中與腺嘌呤配對，從而產(chǎn)生點突變。DNA分子以這種方式產(chǎn)生尿嘧啶很可能就是DNA含有胸腺嘧啶而不是尿嘧啶的原因。因為這樣可使DNA分子中發(fā)現(xiàn)的任何尿嘧啶，均可被一種稱為尿嘧啶DNA糖化酶所切除，并由胞嘧啶所替代。胞嘧啶自發(fā)脫氨基成為尿嘧啶的頻率估計約為每小時每個細胞次，即每天每個細胞次。,.,3堿基的互變異構(gòu)DNA中的四個堿基都可能自發(fā)地使氫原子改變位置而產(chǎn)生互變異構(gòu)體，從而使堿基的配對形式發(fā)生改變。如腺嘌呤的稀有互變異構(gòu)體與胞嘧啶配對，胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤配對。當DNA復制時，如果模板鏈上存在著這樣形式的互變異構(gòu)體，在子鏈上就可以產(chǎn)生錯誤，造成DNA損傷。,.,例如稀有堿基腺嘌呤和胞嘧啶，或稀有堿基胸腺嘧啶與鳥嘌呤形成氫鍵，便可導致下一世代中G-C配對取代A-T配對.?4細胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷在所有需氧細胞中，細胞呼吸作用產(chǎn)生的副產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）和H2O2非?；钴S.由于這些超氧化物、氫過氧化物及羥基自由基（OH）等活性氧的存在，導致DNA在正常條件下發(fā)生氧化損傷。,.,這些自由基可在許多位點上攻擊DNA，產(chǎn)生一系列特性變化了的氧化產(chǎn)物，如8-氧化鳥嘌呤、2-氧化腺嘌呤和5-羥甲基尿嘧啶等。電離輻射引起水分解所產(chǎn)生的羥基自由基，會提高這些氧化產(chǎn)物的水平。氧自由基對DNA的損傷是由金屬離子，尤其是鐵離子所介導的，因此，螯合劑、自由基清除劑、超氧化物歧化酶、二氧化物酶和過氧化物酶活力的增強，都能降低氧自由基的毒性。,.,此外，葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，可能還有其他的糖分子也能和DNA反應，產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)和生物學改變，這些改變的累積可導致細胞老化。除上述自發(fā)性損傷外，DNA分子還會自發(fā)產(chǎn)生單鏈斷裂、鏈間交聯(lián)和形成一些甲基加合物等。,.,（二）物理因素由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。物理的誘變損傷因素可分為電離輻射和非電離輻射兩大類。,.,電離輻射因素,電離輻射的誘變損傷因子主要是由Co60、Cs137發(fā)生的X射線和射線，由H3發(fā)生的射線，由P32、S35發(fā)生的射線等.盡管各類射線能量以及對生物組織和細胞的穿透能力各不相同，但離子射線導致基因