【畢業(yè)學(xué)位論文】PCV2和PRRSV混合感染對仔豬致病性的評估論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 合感染對仔豬 致病性的評估 to 士研究生：溫 永 俊 指 導(dǎo) 教 師：蔡雪輝 副研究員 申請學(xué)位類別：農(nóng) 學(xué) 碩 士 專 業(yè)：預(yù) 防 獸 醫(yī) 研 究 方 向：動 物 病 毒 分 子 生 物 學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：研 究 生 院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 提交日期 2006 年 5 月 he to s. 2006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知, 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外, 論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果 ,也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 合感染對仔豬致病性的評估 論文作者 溫永俊 指導(dǎo)教師 蔡雪輝副研究員 培養(yǎng)單位 哈獸研 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類別 單位 專業(yè) 盲評 盲評 評 閱 人 盲評 答辯 主席 魏萍 教 授 博導(dǎo) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī) 魏萍 教 授 博導(dǎo) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī) 崔玉東 教 授 博導(dǎo) 八一農(nóng)墾大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī) 仇華吉 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī) 馮力 副研究員 碩導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī) 喬傳玲 副研究員 碩導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī) 答 辯 委 員 答辯時間、地點(diǎn) 2006 年 6 月 16 日 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 記 錄 答辯會秘書：劉永剛 摘 要 本研究從接種疑似 豬病料的細(xì)胞中分離出一株 測序基因組全長為 1767列分析并與國內(nèi)外毒株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與法國株 源性較高，可達(dá) 并克隆該分離毒株的 因片段進(jìn)行原核表達(dá)，獲得融合蛋白 驗表明該蛋白具有較好的抗原性，用該蛋白初步建立了檢測 體的間接 法。 通過 毒共感染 3 周齡健康仔豬來評價其致病性。試驗動物隨機(jī)分為 3 組，空白對照組（n=3 頭）， 獨(dú)感染組（n=3 頭）， 感染組 (n=6 頭 )。通過臨床癥狀、病理學(xué)變化、病原學(xué)和血清學(xué)檢查，對混合感染仔豬的致病性進(jìn)行了研究。 合感染組于攻毒后 7 天，開始出現(xiàn)呼吸困難、體溫升高。獨(dú)組出現(xiàn)呼吸困難、中度嗜睡并在攻毒后 28 天恢復(fù)，空白對照組無異常。 出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，淋巴小結(jié)周圍界限不清，脾臟濾泡發(fā)生崩解，細(xì)支氣管周圍有淋巴細(xì)胞增生灶，肝細(xì)胞胞漿 糖原丟失且呈球樣，組織病變與斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (同。 獨(dú)組出現(xiàn)中等程度的增生性間質(zhì)性肺炎。 混合感染組中 體在攻毒后 7 天時開始上升，攻毒后 14 天時抗體水平達(dá)到最高，后逐漸下降；而 體消長規(guī)律與 獨(dú)組相同，在攻毒后 14 天時開始上升，攻毒后 21 天時達(dá)到頂峰，然后開始下降。兩種病毒主要在肺臟、肝臟和脾臟中分布，在腎臟中也少量存在；混合感染組中 分布較 獨(dú)感染組更為廣泛。經(jīng) 現(xiàn)血清中病毒在攻毒后 4 天時檢出，到試驗結(jié)束時仍可檢到，病毒血癥的維持時間較長。 研究結(jié)果表明： 同感染能引起 淋巴組織腫大、出血，肉芽腫性炎癥，壞死性肝炎，仔豬消瘦、 生長緩慢等特征性病變；混合感染能加重 仔豬引起的間質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重程度?；旌细腥究梢猿霈F(xiàn)支氣管肺炎和明顯的肝病變，淋巴結(jié)多呈界限明顯的塊狀出血 ,這是在混合感染組中出現(xiàn)的典型病變。 關(guān)鍵詞 豬圓環(huán)病毒型 (豬繁殖與呼吸綜合征 (混合感染，致病性，原核表達(dá) I he of of (767is up It in a to of we An to of (to n=3), n=3） , n=6), to We of of 8we of of in by or or In of in by in in is In to 4 up 4to 1It is to in in be in th of in CR to to of is to is in of in to is in 目 錄 第一章 緒 論 .原簡介 .行病學(xué)現(xiàn)狀 .床表現(xiàn)及致病機(jī)理 .斷方法研究 .制研究 .究目的 .究內(nèi)容 .二章 毒株的分離鑒定 .料與方法 . 材料 . 病毒檢測引物和全基因引物設(shè)計及合成 . 病料 檢測 . 病毒的分離 . 10 接熒光方法鑒定離株 . 10 離毒株全基因組的克隆與序列分析 . 10 果 . 10 料組織的 . 10 接免疫熒光試驗 . 12 離毒株全基因組的克隆和序列測定 . 12 離毒株的同源性和進(jìn)化 . 13 論 . 15 第三章 . 16 料方法 . 16 粒和菌株 . 16 構(gòu)蛋白的分析 . 16 物的設(shè)計與合成 . 16 . 17 組質(zhì)粒的構(gòu)建 . 17 達(dá)載體的鑒定 . 17 . 17 組蛋白的析 . 17 果 . 18 段的 . 18 . 19 組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 . 19 . 20 組蛋白的測結(jié)果 . 21 論 . 22 第四章 . 23 料與方法 . 23 株和細(xì)胞 . 23 要儀器 . 23 劑及其他材料 . 23 驗設(shè)計 . 23 毒的增殖、提取及 . 23 . 24 織病理學(xué)檢查 . 25 接免疫熒光試驗 . 25 . 25 果 . 26 床癥狀 . 26 眼病變 . 26 織病理學(xué)變化 . 27 原的免疫熒光試驗 . 27 . 27 . 30 . 31 體 . 31 論 . 32 第五章 結(jié) 論 . 33 參考文獻(xiàn) . 34 附 錄 . 38 致 謝 . 47 作者簡歷 . 48 V 英文縮略表 英 文 縮 寫 中 文 名 稱 繁殖呼吸綜合征病毒 圓環(huán)病毒型 細(xì)小病毒 偽狂犬病毒 酸脫氫酶增高癥病毒 動脈炎病毒 腎細(xì)胞 洲綠猴腎細(xì)胞克隆株 肺泡巨噬細(xì)胞 血管內(nèi)巨噬細(xì)胞 呼吸道疾病綜合征 腎病皮炎綜合征 體依賴性病毒增強(qiáng)作用 特定病原體動物 接免疫熒光試驗 位核酸雜交試驗 疫過氧化物酶單層試驗 疫印跡法 焦碳酸二乙酯 0中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 第一章 緒 論 原簡介 豬繁殖與呼吸綜合征(是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (起的，以母豬的繁殖障礙、仔豬的高死亡率及呼吸癥狀為特征的一種傳染病。該病 1987 年在美國首先發(fā)生，隨后在世界各主要養(yǎng)豬國家流行。 我國 1996 年由郭寶清等首次報道該病，研究證明其為美洲型 (郭寶清等， 1996)。 我國大部分地區(qū)均有流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（蔡雪輝等， 2000）。本病的主要臨床癥狀為發(fā)病母豬出現(xiàn)發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、弱產(chǎn)及木乃伊胎；種公豬出現(xiàn)性功能下降，精液質(zhì)量和精子活力下降；仔豬和育肥豬表現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，呼吸困難、急促、呈間質(zhì)性肺炎、耳部和肢體發(fā)紺。本病極易引起繼發(fā)感染，從而加劇病情，使死亡率升高。如果豬是首次感染發(fā)生此病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前， 染已成為哺乳仔豬和育肥豬肺炎的主要病因之一。經(jīng)常繼發(fā)細(xì)菌或其它病毒感染，使臨床癥狀變得更加復(fù)雜。 呈地方流行。并且出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖減退現(xiàn)象（趙得明等， 1999） 。近年來我國分離的病毒株大多屬于美洲亞群, 但也發(fā)現(xiàn)歐洲亞群 存在（姜平等，1999）。 1991 年，豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （ 在荷蘭的萊利斯塔鎮(zhèn)首次分離鑒定 （ et 1991）。 乳酸脫氫酶增高癥病毒 (馬動脈炎病毒 (能在核苷酸序列、基因結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制等方面都存在極大的相似性（ et 1995） 。因而推測 能起源于同一病毒祖先。但目前還沒有 豬體內(nèi)增殖或 et 1994）。 洲型分離株與 核苷酸同源性高于 洲型分離株與 同源性，說明 美洲和歐洲亞群在未引起 臨床癥狀之前，可能已經(jīng)發(fā)生了各自的進(jìn)化（ et 1995） 。美洲流行 久，歐洲也開始流行。目前大多數(shù)學(xué)者推測 洲分離株和歐洲分離株可能起源于同一病毒祖先，但屬于兩種不同的亞群，兩個亞群分別以各自的方向進(jìn)化?，F(xiàn)在已證實美洲分離株和歐洲分離株在抗原性、基因結(jié)構(gòu)、致病性方面存在較大的差異，因此已將其分為兩個不同的亞群 :歐洲亞群和美洲亞群（ et 1993） 。最初依據(jù)其形態(tài)、理化特性等特點(diǎn)將 入披膜病毒科，動脈炎病毒屬。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)動脈炎病毒與披膜病毒基因結(jié)構(gòu)、蛋白合成等顯著不同（ et 1991） 。因此 1997 年將其列入動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬（ 997）。 一種有囊膜的單股正鏈 毒。病毒粒子呈球形或卵圓形。直徑約為 45 65有 20 35二十面體對稱，外繞一層脂質(zhì)雙層膜，表面有小而不顯著的纖突。在蔗糖中的浮密度為 氯化銫梯度中浮密度為 豬圓環(huán)病毒（ 無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 病毒粒子直徑約17 20迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。 為兩種基因型或血清型，即 廣泛存在豬體內(nèi)及豬源細(xì)胞系； 國學(xué)者 (1974)從多株連續(xù)傳代的 毒相似的小球形病毒，該病毒可以持續(xù)感染 引起細(xì)胞病變。經(jīng)進(jìn)一步證實（et 1982）， 胞的豬腎組織，因該病毒的基因組由一個單股呈圓環(huán)狀的 將其命名為豬圓環(huán)病毒。 同屬的病毒還包括鸚鵡喙羽病病毒、鴿圓環(huán)病毒（ et 2001） 、鵝的圓環(huán)病毒。 分子量為580毒衣殼蛋白為一條多肽鏈，分子量為360降系數(shù)為52S ，浮密度為137g/et 1982） 。該病毒無囊膜，對外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在酸性環(huán)境及氯仿中可以存活很長時間，即使在高溫環(huán)境（72）也能存活一段時間。 能凝集牛、羊、豬、雞等多種動物和人的紅細(xì)胞（et 1994 ）。 因組非常小， 767768一血清型（基因型）內(nèi)部各毒株核苷酸序列非常保守，同源性均在 90%以上，而2 種血清型毒株之間的序列相似性低于80% （ et 2000； et 1998） 。應(yīng)用軟件（ et 1998）對 現(xiàn) 2種 開放閱讀框（ （見表1 ），即 部分閱讀框都有部分重疊，從而可以充分利用圓環(huán)病毒有限的遺傳物質(zhì)，這可能是生物進(jìn)化過程中自然選擇的結(jié)果。2、 3、 4、 7、 8具有一定的同源性，而其余 2為最大的2 個開放閱讀框。 順時針方向排列； 逆時針方向排列。兩種 85% ； 苷酸序列同源性僅為66% 。11838）的基因片段中，該片段介于et 1997） 。該區(qū)域具有多個特征性結(jié)構(gòu)，包括圓環(huán)病毒特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ 其頂部保守的九核苷酸基序（ 、位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游的4 個六聚體重復(fù)（5）（ ，其中 4相鄰，而 3之間有 5 九核苷酸基序略有差異， 而 第一個T 變成了 A（ et 2001） 。這個九核苷酸基序?qū)τ诓《?在所有具有環(huán)狀單鏈 物 菌復(fù)制子如 均高度保守（ et 2002）， 這里起始，如發(fā)生突變將嚴(yán)重影響病毒的繁殖復(fù)制（et 1997）。 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 很難復(fù)制出呈現(xiàn)典型臨床癥狀的 些研究表明 這些病毒與 床癥狀和病理損傷。目前認(rèn)為，常和細(xì)小病毒（ 狂犬病毒（合感染而導(dǎo)致豬的免疫抵抗力降低。 是許多刺激因子在病機(jī)制中具有重要性。 泛分布于世界各地，它們主要侵害豬體的免疫系統(tǒng)，干擾豬體內(nèi)防御系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，使豬對多種病原易感性增強(qiáng)。目前規(guī)模化豬場內(nèi) 和感染十分嚴(yán)重。 行病學(xué)現(xiàn)狀 混合感染是目前造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重?fù)p失的重要因素，國內(nèi)外學(xué)者在這個方面進(jìn)行了大量的研究。安徽某養(yǎng) 豬場斷乳仔豬發(fā)生的一種以漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難、咳喘、昏睡、死亡率增高為 特征的疾病進(jìn)行檢測。根據(jù)發(fā)病情況、臨床觀察、剖檢變化及試驗室檢驗確診為 發(fā)感染后繼發(fā)多種細(xì)菌混合感染 (周俐兵等，2002) 。上海地區(qū) 6 個規(guī)?；i場檢測，剖檢的 18 頭發(fā)病仔豬都表現(xiàn)肺臟嚴(yán)重病變和淋巴結(jié)腫大、出血，并且采用 法從患病豬肺臟組織均擴(kuò)增出 特異性基因片段。結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)調(diào)查，證實上海地區(qū)出現(xiàn)了 混合感染（李玉峰等，2003）。通過 法檢測上海、浙江、山東等地 38 份患有呼吸道疾病的組織病料，其中 為陽性的比例高達(dá) 蘆銀華等， 2003） 。南寧市郊縣某養(yǎng)豬場送檢的病豬進(jìn)行檢查也發(fā)現(xiàn)，豬只發(fā)生 混合感染(蔣小紅等， 2002)。全國 48 個發(fā)生豬呼吸道綜合征（ 豬場多病原混合感染情況用 法檢測，發(fā)現(xiàn) 染占 衛(wèi)秀余等,2004) 。 用 法對韓國全國的豬場連續(xù) 3 年普查發(fā)現(xiàn)， 混感嚴(yán)重，呈逐年上升趨勢（ et 2001）。 對 2000 年 1月至 2001 年 9 月期間送檢的 4688 份樣品作了 疫組化檢測， 從淋巴結(jié)和肺臟中檢出 原，以淋巴組織腫大、出血等作為判定發(fā)生 標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)的 發(fā)生在 8 18 周齡，10 周齡為高峰期。檢測樣品中 1751 份樣品( 為 性，有 484 份樣品 (滿足 斷標(biāo)準(zhǔn)。在所有原陽性的豬中，484 份 (證實有 淋巴組織病變特征。由不同病原體與 同感染引起的 ， 經(jīng)血清學(xué)分析病例數(shù)如下 :豬肺炎支原體為 細(xì)菌性敗血癥為 14%，細(xì)菌性肺炎為 豬流感病毒為 僅由 獨(dú)引起的只有 細(xì)菌性敗血癥中分離到最多的病原體是豬鏈球菌。細(xì)菌性肺炎病例中以多殺性巴氏桿菌為主（ et 2002）。 荷蘭學(xué)者對 20 個呈 床癥狀豬場的 60 頭和沒有 床癥狀的 1803中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 頭對照豬進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn) 混合感染率很高。利用 法或病毒分離技術(shù)對有 床癥狀的豬進(jìn)行檢測， 出率為 100%； 對無 出率為 50%。研究結(jié)果表明，病豬消耗性臨床癥狀的嚴(yán)重程度與體內(nèi)病毒載量的水平呈正相關(guān)。目前在有 床癥狀的豬群中 混合感染發(fā)生率至少為 83%，在無 床癥狀的豬群中 混合感染發(fā)生率為 35%(et 2004)。 為了調(diào)查澳大利亞豬群中是否存在 而對檢測到的病毒進(jìn)行基因特性分析，從而澄清為何某些國家豬群中豬圓環(huán)病毒與 關(guān)，而在某些國家如澳大利亞卻無關(guān)，究竟是何原因目前 尚不清楚。在澳大利亞西部隨機(jī)抽檢的 14 個豬場的血清樣品；同時對一個豬場 2 12 周齡的豬每兩周收集一次血清樣品，來觀察感染流行在日齡上的差異。用間接免疫熒光法檢測血清，用套式 果發(fā)現(xiàn)澳洲西部大約 30%豬只 體陽性；在澳洲同時存在 洲西部、南部和新南威爾士檢測到 洲南部、新南威爾士和昆士蘭州檢測到 序列分析發(fā)現(xiàn)這些毒株與當(dāng)前發(fā)生家的毒株非常相似。但是澳大利亞沒有發(fā)生 關(guān)的 測可能是在澳洲不存在能誘發(fā) 生 關(guān)鍵性因素（ et 2005）。 通過上述流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著國內(nèi)外 混合感染相關(guān)報道逐漸增多，說明豬群中發(fā)生混合感染已經(jīng)十 分普遍，世界養(yǎng)豬業(yè)又一次受到了嚴(yán)重的威脅。對此研究者也建立了一系列診斷 和監(jiān)測的方法，但確切的感染機(jī)理尚不是很明確，在混合感染發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理 和免疫預(yù)防等各方面都需要進(jìn)行深入研究。 床表現(xiàn)及致病機(jī)理 同感染豬只表現(xiàn)被毛粗亂、消瘦、皮膚蒼白、腹瀉、呼吸困難、昏迷，偶爾出現(xiàn)黃疸，死亡率較高。剖 檢發(fā)現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大 2 3 倍，切面多汁；整個肺顏色變淺，有點(diǎn)狀出血，有些地方出現(xiàn)肉變或胰變，按壓無彈性；腎臟質(zhì)地變脆，表面有針 尖大小出血點(diǎn)，甚至塊狀出血斑；脾臟表面有少數(shù)出血點(diǎn)，邊緣有少量梗死灶； 嚴(yán)重的出現(xiàn)增生性間質(zhì)性肺炎和特別明顯的肝病變。 在 2000 2003 年分別利用剖腹產(chǎn)不吃初乳（ 、不吃初乳（ 無特定病原（ 復(fù)制了 過病理學(xué)、免疫熒光、病毒分離檢測等手段證實混合感染比二者任何一種單獨(dú)感染都嚴(yán)重（ et 2000）。 周齡分別感染 及共同感染以上兩種病毒，比較病毒單獨(dú)作用或聯(lián)合作用的效果 ，并于接種后不同日齡及豬瀕死時剖檢。在接種后第 10 天， 迷，偶爾出現(xiàn)黃疸，接種 10 天后 91%死亡， 20 天后全部死亡。 獨(dú)感染組出現(xiàn)4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 昏迷，散發(fā)性黃疸， 42%出現(xiàn)滲出性皮炎，死亡率為 26%。 28 天時恢復(fù)， 和 合感染組也出現(xiàn)了嚴(yán)重的增生性間質(zhì)性肺炎和特別相似的肝病變，損傷嚴(yán)重的絕大多數(shù)組織細(xì)胞中含有 原。 未出現(xiàn)支氣管 炎或肝病變以及淋巴組織萎縮。研究表明合感染能加重 不是 芽腫性炎癥，壞死性肝炎等特征病變。 et 2001）。 只自然發(fā)生豬腎性皮炎綜合征（