【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）ERF轉(zhuǎn)錄因子LeERF2、JERF2在非生物脅迫應(yīng)答中的功能分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士論文

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 I 密級： 論文編號 ： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 錄因子 非生物脅迫應(yīng)答中的功能分析 o. 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 要 基因表達(dá)調(diào)控是植物脅迫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。植物激素和轉(zhuǎn)錄因子對植物脅迫應(yīng)答中的基因表達(dá)調(diào)控起著關(guān)鍵性的作用。 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一個轉(zhuǎn)錄因子大家族，它們都具有一 個保守的 合域 轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)植物對病原物、低溫、干旱、高鹽及傷害等生物與非生物脅迫的適應(yīng)性應(yīng)答，在植物脅迫應(yīng)答中起著重要的作用。乙烯是植物體內(nèi)一種多功能植物激素。早期研究表明 ,在植物的生物脅迫應(yīng)答中乙烯可以通過 錄因子調(diào)節(jié)大量含有 因表達(dá)，提高植物對生物脅迫的抗 /耐性 , 在植物的生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。近幾年的研究表明乙烯也可以通過 錄因子參與植物的非生物脅迫應(yīng)答，提高植物的非生物脅迫耐性。本實驗室以 用酵母單雜交系統(tǒng)從番茄 達(dá)文庫中篩選到兩個新基因 究表明它們都屬于 轉(zhuǎn)錄因子，并參與乙烯和植物的非生物脅迫應(yīng)答。本實驗是在我們實驗室原有的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了 分析它們可能參與的調(diào)控途徑。 凝膠阻滯實驗（又稱 果表明 白具有結(jié)合 不能同 聯(lián)元件 合。轉(zhuǎn) 因煙草的交結(jié)果表明 超表達(dá)除了導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草中含有 基因 組成型表達(dá)外，某些含有 式作用元件的基因 組成型表達(dá)。但另外一些含有 基因如 含有 基因表達(dá)則不受影響。分別用 露醇和葡萄糖處理野生型和 基因煙草種子時發(fā)現(xiàn) 高了轉(zhuǎn)基因煙草種子的脅迫耐性。低溫處理轉(zhuǎn)基因煙草時，高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐凍性。用 理煙草植株八小時并恢復(fù)生長兩天，野生型煙草的死亡 率達(dá)到 而轉(zhuǎn)基因植株僅為 17%。此外 提高轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根的鹽脅迫耐性。這些結(jié)果表明 因可能通過調(diào)節(jié)某些含有 式作用元件的基因的表達(dá)參與植物的非生物脅迫應(yīng)答，提高了植物的非生物脅迫耐性。 對 研究表明 高了轉(zhuǎn)基因煙草種子對 甘露醇的脅迫耐性，而中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 理轉(zhuǎn)基因煙草種子時發(fā)現(xiàn) 功能沒有明顯的影響。對轉(zhuǎn)基因煙草植株的研究表明 高了轉(zhuǎn)基因植株提對 理下的滲透脅迫的耐性，也顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙 草對 脅迫耐性。轉(zhuǎn)基因煙草的 交結(jié)果表明 超表達(dá)可造成某些含有 對含有 含有 式作用元件的基因 些結(jié)果表明 能通過調(diào)節(jié)某些含有 基因的表達(dá)而提高了植物的非生物脅迫耐性。另外 基因煙草的乙烯三重反應(yīng)實驗表明 與植物體內(nèi)的其它功能。以上實驗結(jié)果證明 與植物非生物脅迫應(yīng)答，提高植物對非生物脅迫的耐性。表明了 轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答中具有重要作用。 關(guān)鍵詞 ：非生物脅迫，乙烯， 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 t is to of to an on of a NA to of as to a is to RF a on to of is an a of on T is to to by of R RF T on to of RF of by of to RF is to in to of on of of to RT in We in of RT in as in no on in of by of is 0% of 6 is 7%. of of of we of by of RT in of of of EG of of in in to RT in we 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 V of on T. in to of of 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 目錄 第一章 前言 . 1 究的目的和意義 . 1 . 1 種植物脅迫應(yīng)答激素、轉(zhuǎn)錄因子和順式作用 元件在植物脅迫應(yīng)答中的作用 . 1 . 4 烯和 錄因子在植物脅迫應(yīng)答中的研究進(jìn)展 . 5 . 5 . 7 烯和 錄因子在植物脅迫應(yīng)答中的功能 . 9 究內(nèi)容和方法 . 11 . 11 . 12 第二章 . 13 第一 節(jié) 轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫應(yīng)答中的功能 . 13 料 . 13 . 13 . 13 用溶液配制 . 13 的配置 . 13 . 13 驗方法 . 13 . 13 迫條件下萌發(fā)的實驗方案 . 14 件下萌發(fā)的實驗方案 . 14 條件下萌發(fā)的實驗方案 . 14 . 14 . 14 果分析 . 15 迫條件下萌發(fā)的實驗結(jié)果 . 15 因煙草在滲透脅迫 （ 條件下萌發(fā)的實驗結(jié)果 . 15 件下萌發(fā)的實驗結(jié)果 . 16 . 17 . 17 . 18 第二節(jié) 原核表達(dá)及其 合特性的分析 . 19 料與方法 . 19 驗材料 . 19 及試劑 . 19 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 . 19 用溶液配制 . 19 . 19 般溶液的配制 . 20 驗試劑配制 . 20 驗方法 . 21 質(zhì) 粒 . 21 . 21 質(zhì)粒載體上擴(kuò)增所需目的片段（ 50 . 21 . 22 脂糖凝膠中 段的回收 . 23 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 23 . 24 組子 . 24 . 24 鑒定正確的 . 25 . 25 白的原核誘導(dǎo)表達(dá)及純化 . 25 白電泳遷移率實驗 . 27 果與分析 . 29 . 29 化 了 . 29 . 30 驗結(jié)果 . 31 第三節(jié) 交分析 下游基因表達(dá)的調(diào)控作用 . 32 料 . 32 . 32 . 32 . 32 用溶液配制 . 32 驗方法 . 33 . 33 . 33 . 34 交 . 34 果與分析 . 36 結(jié) . 37 第三章 植物非生物脅迫應(yīng)答中的功能分析 . 38 第一節(jié) 植物非生物脅迫應(yīng)答中的功能 . 38 料 . 38 實驗材料 . 38 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 . 38 用溶液配制 . 38 驗方法 . 38 . 38 迫條件下的萌發(fā)實驗方案 . 38 件下的萌發(fā)實驗方案 . 39 . 39 . 39 . 39 煙草三重反應(yīng)實驗方法 . 39 驗結(jié)果與分析 . 40 迫條件下萌發(fā)的實驗結(jié)果 . 40 . 41 . 41 . 42 . 43 . 43 第二節(jié) 交分析 下游基因表達(dá)的調(diào)控作用 . 44 料 . 44 . 44 . 44 用溶液配制 . 44 驗方法 . 44 . 44 . 44 . 44 交 . 44 驗結(jié)果與分析 . 45 結(jié) . 45 討論 . 47 結(jié)論 考文獻(xiàn) . 50 致 謝 . 56 作者簡介 . 57 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 縮 略 詞 表 英文縮寫 英文名稱 中文名稱 脫落酸 BA 落酸應(yīng)答元件 性亮氨酸拉鏈 合因子 補(bǔ) 椰菜花葉病毒 溫調(diào)控 嘧啶重復(fù)序列 旱應(yīng)答元件 旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 化乙錠 二胺四乙酸 膠電 泳遷移改變實驗 烯應(yīng)答元件 烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 烯應(yīng)答元件結(jié)合因子 ET 烯 敏反應(yīng) 丙基 硫代半乳糖苷 JA 莉酸 A- 莉酸激發(fā)子應(yīng)答元件 莉素乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子 那霉素 養(yǎng)基 莉酸甲酯 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 X -(-( S 鹽 密度 酯酰 構(gòu)域 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 程相關(guān) 作蛋白 rd to 旱應(yīng)答 分鐘轉(zhuǎn)速 楊酸 統(tǒng)獲得性抗性 楊酸應(yīng)答元件 1,3羥甲基氨基甲烷 煙草脅迫誘導(dǎo)基因 1 43 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 前言 1 第一章 前言 究的目的和意義 境脅迫與植物的脅迫應(yīng)答 植物生長在特定的環(huán)境條件下，外界環(huán)境條件的變化不同程度影響著植物生長發(fā) 育過程及狀態(tài)。植物對生長環(huán)境的依賴性同植物生長環(huán)境條件的動態(tài)性，要求植物迅速應(yīng)答和有效適應(yīng)外界環(huán)境條件的改變。在長期進(jìn)化選擇的過程中，植物形成了一整套比較完善的適應(yīng)外界環(huán)境條件變化的信號感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)答機(jī)制。植物對環(huán)境條件的適應(yīng)是多方面多層次的。一方面，植物在組織、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育等方面高度適應(yīng)適應(yīng)生長環(huán)境；另一方面，植物通過基因的表達(dá)調(diào)控適應(yīng)外界環(huán)境條件的波動。植物激素作為植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和脅迫應(yīng)答中起著重要的作用。植物在受到某一環(huán)境因素的脅迫時會合成一種或幾種特異的植物激素 ，并通過這些植物激素調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，改變植物的代謝方式，甚至調(diào)控植物的發(fā)育進(jìn)程以適應(yīng)外界環(huán)境條件。乙烯（ 脫落酸（ 水楊酸（ 茉莉素（ 植物激素在植物的脅迫應(yīng)答中都起著重要的作用 (1997； et 2000； et 2000；Yu et 2001； et 2002； 2002； 2003)?；虻谋磉_(dá)調(diào)控在 植物的脅迫應(yīng)答中起著同樣重要的作用。植物通過特異基因的迅速激活或鈍化，可以適時、靈敏、經(jīng)濟(jì)有效的適應(yīng)環(huán)境脅迫。植物中存在大量脅迫相關(guān)的基因，其中轉(zhuǎn)錄因子又起關(guān)鍵性作用的基因。一個轉(zhuǎn)錄因子可以特異的調(diào)控多個脅迫相關(guān)的下游基因的表達(dá)，這樣植物轉(zhuǎn)錄因子就可以靈敏，有效的調(diào)節(jié)大量脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，適應(yīng)外界脅迫條件。植物含有許多轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥基因組中含有大約 1500個轉(zhuǎn)錄因子 （ et 2000） 。這些轉(zhuǎn)錄因子形成多個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中同植物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有三個： et 2000； et 2001； et 2002）。這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)大量下游功能基因如 因、 以提高植物脅迫耐性（ et 1993； 余叔文等， 1998； et 1999） 。雖然這些下游功能基因可通過一條或幾條相同或不同的信號途徑參與植物的脅迫應(yīng)答，但其中絕大 部分是通過植物激素和 /或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子完成其脅迫應(yīng)答的。植物通過激素、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（如轉(zhuǎn)錄因子）、下游功能基因協(xié)同作用有效地完成脅迫應(yīng)答反應(yīng)。 種植物脅迫應(yīng)答激素、轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件在植物脅迫應(yīng)答中的作用 茉莉酸（ 其衍生物是一類新型植物激素 ,它們結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)是具有環(huán)戊烷酮 ,統(tǒng)稱為茉莉素（ 茉莉素功能廣泛，與植物的多種生理功能相關(guān)，如：抑制光合作用；促進(jìn)呼吸作用，氣孔關(guān)閉；葉片衰老脫落以及果實成熟；傷害、機(jī)械壓力、病原物侵入以及滲透脅迫等 (余叔文等 ,1998)。茉莉素能調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種蛋白，特別是植物防御和脅迫蛋白的表達(dá)。對擬南芥 失型突變體的研究也證明茉莉素參入調(diào)控植物整體抗性，包括抗蟲性、抗病性、抗傷害以及抗干旱 (et 1997； et 1998)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 前言 2 水楊酸（ 樣也參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的多種生理生化過程，如植物開花、種子發(fā)芽、氣孔關(guān)閉、膜通透性及離子的吸收等，是一種新的植物內(nèi)源激素 ( et 1994)。 近來又發(fā)現(xiàn)加速被侵染部位細(xì)胞的死亡、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性產(chǎn)生、誘導(dǎo)某些抗性基因及抗性相關(guān)蛋白的表達(dá)、影響植株的某些抗性生理反應(yīng)等等，能誘導(dǎo)植物提高抗病性產(chǎn)生抗鹽性狀，還可提高植物抗脫水能力及抗瘟性（ et 2000； et 2002）。脫落酸（ 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一種多功能激素。它參與植物胚胎發(fā)育、種子休眠、果實成熟以及逆境脅迫應(yīng)答，如抗脫水、干旱、高鹽、低溫及抗病蟲害和機(jī)械損傷等多方面生理功能 (et 1994; et 1992; et 1994)。 為它同種子休眠，葉子衰老脫落有關(guān)。后來研究發(fā)現(xiàn) 植物的非生物脅迫中起著更重要的作用，它可以通過et 1998） 。乙烯作為一種氣體植物激素參與植物眾多的發(fā)育調(diào)控和適應(yīng)性應(yīng)答，包括種子的萌發(fā)、花和果實的凋亡，葉片的脫落，果實的成熟，根瘤的形成，細(xì)胞的程序性死亡，對病原物侵入及低溫、干旱、鹽 堿及傷害等生物和非生物脅迫的應(yīng)答 （ et 1998, 000）。乙烯在植物脅迫應(yīng)答中的作用最初主要集中研究其對植物抗病性的影響 （ et 1998； et 1999； et 2002） 。近幾年隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)乙烯在植物的非生物脅迫，特別是對植物的低溫、鹽堿耐性方面同樣起著重要的作用 （ Yu et 2001, et 2002） 。目前關(guān)于乙烯在植物體 內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究取得了長足的進(jìn)展。通過對擬南芥大量乙烯突變體的研究，人們對乙烯細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和機(jī)制已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識，乙烯信號傳導(dǎo)途徑上的許多重要成分已經(jīng)被克隆和詳細(xì)研究 （ 2004） 。但乙烯在非生物脅迫應(yīng)答中的分子機(jī)理研究較少，對乙烯在非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制的闡述也還不夠清楚。在乙烯和非生物脅迫的關(guān)系上仍然有大量問題有待研究和闡明，主要表現(xiàn)在：乙烯同其它信號途徑如植物激素 光，溫，代謝調(diào)節(jié)等信號途徑之間相互關(guān)系還不很明了；另外，雖然研究表明許多 逆境比如低溫，干旱，高鹽，病原物均能誘導(dǎo)乙烯的生成，研究也表明脅迫下許多乙烯相關(guān)的功能蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，但對乙烯生成和功能基因表達(dá)之間關(guān)系的研究不多也不十分清楚；此外脅迫條件下乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的功能基因與乙烯在植物形態(tài)發(fā)育方面的功能之間的相關(guān)性引起越來越多的關(guān)注（ Yu et 2001）。 生物在生長發(fā)育過程中受遺傳信息和環(huán)境信息的共同調(diào)控，要求對各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控，協(xié)調(diào)完成對內(nèi)外環(huán)境條件的應(yīng)答。植物能感受各種外界環(huán)境刺激，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激發(fā)反式作用因子，而反式作用因子與順式作用組件結(jié)合 后，又激活 合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而啟動基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些基因產(chǎn)物行使不同的功能，最終完成植物對外界信號在生理生化等方面的脅迫應(yīng)答反應(yīng)。在植物的脅迫應(yīng)答中不同的脅迫信號可以通過多信號途徑的相互作用形成一個迅速、有效、協(xié)調(diào)的信號網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)植物的脅迫應(yīng)答。在這個過程中轉(zhuǎn)錄因子與順式作用組件的識別起到重要的作用 (2001； 2003； 2003)。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與基因啟動子區(qū)域 中順式作用組件發(fā)生特異性相互作用的 過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。通過這種方式，轉(zhuǎn)錄因子可以同時調(diào)控大量相關(guān)下游基因的表達(dá)，使植物迅速地適應(yīng)環(huán)境條件的變化，并通過與順式作用組件的特異性識別，調(diào)控特異的基因表達(dá)，協(xié)調(diào)植物與環(huán)境的關(guān)系。所以轉(zhuǎn)錄因子和順式組件協(xié)調(diào)作用可以靈敏、高效、特異的完成植物脅迫應(yīng)