ELISA所需緩沖液的配方

一、做ELISA確定抗原最佳包被濃度，做方陣滴定具體怎么做呢？選擇好一份已知為陽(yáng)性和陰性背景的標(biāo)本，將你的抗原用1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4進(jìn)行倍比稀釋（8個(gè)條件）后加入96孔板每孔100ul。（一般包被濃度100ng抗原或抗體/孔，最優(yōu)包被條件需進(jìn)行試驗(yàn)選擇）4度過(guò)夜取出后甩干，加入20%NBS封閉每孔200ul。37度2h熱封，甩去后拍干即可。將你HRP或AP標(biāo)記的抗原或二抗用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行稀釋（倍比稀釋4個(gè)梯度）即可。棋盤滴定就是板酶交叉,同時(shí)帶上陽(yáng)性、陰性通過(guò)試驗(yàn)確定最佳P/N的包被搭配E的試驗(yàn)2抗原和抗體最佳工作濃度的確定抗原抗體反應(yīng)要求在最適比例條件下進(jìn)行，ELISA反應(yīng)試劑多，其工作濃度不同對(duì)結(jié)果影響較大，因此必須對(duì)包被抗原(抗體)和酶標(biāo)抗體(抗原)進(jìn)行最佳工作濃度的滴定和選擇，以達(dá)到最佳的測(cè)定條件。1）方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度 用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50l:800)后，按行進(jìn)行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對(duì)照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清A值；為08左右，陰性參考血清A值01的包被抗原稀釋度為工作濃度。方陣(棋盤)法選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度 將抗體用包被液稀釋為10mgL、lmgL、0.1mgL三個(gè)濃度按行包被，每一個(gè)濃度包被三行(每行3孔)，分別在每個(gè)濃度包被的第一、二、三行中分別加入強(qiáng)陽(yáng)性抗原，弱陽(yáng)性抗原和陰性對(duì)照，將酶標(biāo)抗抗體用稀釋液稀釋為1:l 000、l:5000、l:10000三個(gè)濃度，分別加入每個(gè)濃度包被的第一、二、三列中。加底物顯色，加酸終止反應(yīng)，分別讀取A值。以強(qiáng)陽(yáng)性抗原液A值在0.8左右，陰性參考A值0.1的條件為最適條件。據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度。二、ELISA最適工作濃度的選擇及標(biāo)準(zhǔn)化操作1最適工作濃度的選擇11間接法測(cè)抗體酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇：用IgG進(jìn)行包被，洗滌。將酶標(biāo)IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)。讀取A值在10時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)IsC的工作濃度應(yīng)為11600。棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度：用包被液將抗原由1：50開(kāi)始作比倍稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。將強(qiáng)陽(yáng)性參考血清、弱陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1：100稀釋，加樣，保溫、洗滌。加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)IsC抗體，保溫、洗滌。加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清的A值為08左右、陰性參考血清的A值小于01的包被抗的稀釋度作為工作濃度，從中選取最適工作濃度。12夾心法測(cè)抗原在夾心ELISA法中，可用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度?？贵w免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為100、10和01微克毫升，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，每一濃度包括3個(gè)縱行，洗滌。在1個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽(yáng)性抗原液，另1橫行加入弱陽(yáng)性抗原液，第3橫行加入陰性對(duì)照液，保溫、洗滌。將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成3個(gè)濃度，例如1：1000、1：5000和1：25000。分別加入每個(gè)包被濃度的1個(gè)縱行中，保溫、洗滌。加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。以強(qiáng)陽(yáng)性抗原的A值在08左右、陰性參考的A值小于01的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶抗體的工作濃度，從中選取包被抗體濃度和酶標(biāo)抗體的稀釋度。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點(diǎn)，縮小間距再進(jìn)一步做棋盤滴定。2測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)化21加樣ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行96孔加樣。定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性。例如規(guī)定為加樣1滴，如不具備相當(dāng)?shù)臈l件，要盡量使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì)，使每滴液體的體積基本相同。在定量測(cè)定中，加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確，最好采用量程準(zhǔn)確的微量移液器。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出現(xiàn)氣泡。22保溫在ELISA中，一般在加標(biāo)本和結(jié)合物后，反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其，以平衡溫度。23洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯一類物質(zhì)即避免非特異性吸附，在ELISA中最為常用。ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：吸干孑L內(nèi)反應(yīng)液；將洗滌液注滿板孔；放置2分鐘，略作搖動(dòng)；吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3-4次，有時(shí)甚至需洗5-6次。如有專用洗滌機(jī)，應(yīng)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的洗滌步驟，并定期檢查洗滌液，保證洗滌質(zhì)量。24比色陰性對(duì)照顏色極淺，在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。在目測(cè)法中，待檢血清與抗原對(duì)照反應(yīng)孔和待檢血清與特異抗原反應(yīng)孔均呈無(wú)色或極淺色，判為陰性；待檢血清與抗原對(duì)照反應(yīng)孔無(wú)色或極淺色，而與特異抗原呈橘黃色，判為陽(yáng)性。如用比色計(jì)測(cè)定結(jié)果，其準(zhǔn)確性則決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。三、ELISA法抗原包被的濃度如何確定？ELISA法進(jìn)行抗原包被的時(shí)候，抗原包被的濃度是如何確定的。看到有些資料中方陣滴定法，稀釋抗原和血清，以強(qiáng)陽(yáng)性抗原液A值在0.8左右，陰性參考A值0.1的條件為最適條件。為什么選擇這個(gè)為最適條件？弱陽(yáng)性血清有什么用處？在摸索包被濃度的時(shí)候，血清中抗體的含量是固定的嗎？需要提前定值嗎？急需答案一般我們做的時(shí)候抗原抗體兩個(gè)變量，抗原的濃度是根據(jù)你的抗原的純度來(lái)定的，一般純化的蛋白是2ng，有時(shí)候是要抗體的滴度，抗原濃度固定，抗體或者血清就要拉稀釋度，這和酶標(biāo)儀的靈敏性有關(guān).一般OD值在1.0左右酶標(biāo)儀比較靈敏，測(cè)量的數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確.OD值如果很深,達(dá)到2點(diǎn)幾就不靈敏了.所以我們一般選OD值在1.0左右進(jìn)行分析.OD 1.0-1.5之間最佳，當(dāng)然依據(jù)酶標(biāo)儀的性能而定。個(gè)人覺(jué)得棋盤ELISA一定要選擇OD1.0的點(diǎn)是個(gè)誤區(qū)。首先不同型號(hào)的靈敏度應(yīng)該是不一樣的；其次OD為1.0指的是某個(gè)抗原抗體濃度條件下的OD值，并不代表通過(guò)此次棋盤得到的最佳抗原抗體的濃度所做的各種后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn)的值也是1.0左右，所以說(shuō)選擇處于酶標(biāo)儀靈敏度的最佳狀況并不一定符合后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。（不善表達(dá)，不知自己描述清楚沒(méi)有）我自己覺(jué)得要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)類型（間接，雙抗夾心或是競(jìng)爭(zhēng)等）來(lái)選擇最佳抗原抗體工作濃度。象競(jìng)爭(zhēng)ELISA，做棋盤的目的是包被抗原和一抗的量，試想如果包被抗原太濃，意味著需要競(jìng)爭(zhēng)抗原濃度也不能?。ó吘故歉?jìng)爭(zhēng)對(duì)手不能懸殊太大），這就注定了競(jìng)爭(zhēng)ELISA的檢測(cè)限不好（因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)抗原往往是要檢測(cè)的東西，所需濃度越大IC50也就越大）。而一抗也不能足量，否則即能與包被抗原反應(yīng)又能與檢測(cè)抗原反應(yīng)，就不能稱為競(jìng)爭(zhēng)ELISA了。也不能太少，否則整體OD讀數(shù)太低。雙抗夾心ELISA也是同樣的道理，找到包被抗體和酶標(biāo)抗體的平衡點(diǎn)，即能OD與本底之間的平衡點(diǎn)。四、elisa試劑盒Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測(cè)試劑盒是用于體外定性檢測(cè)人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測(cè)。（一）、ELISA簡(jiǎn)介elisa技術(shù)流程ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。然而，影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。（二）Elisa試劑盒測(cè)定技術(shù)的發(fā)展臨床測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。目前，分子生物學(xué)正在并最終肯定會(huì)讓我們對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而徹底的認(rèn)識(shí)，其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對(duì)以前一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。（三）基因工程試劑對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開(kāi)優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各種化學(xué)合成方法制備。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。HBsAg試劑特點(diǎn)（檢測(cè)模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗。多抗具有高親和性和對(duì)抗原各種表位的反應(yīng)性。酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位，可測(cè)得HBsAg變異樣品，提高檢測(cè)的特異性（99.98%）提高檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)用Parl Ehrich 學(xué)說(shuō)（PEI）HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05ng/ml對(duì)ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml（四）測(cè)試劑盒檢測(cè)原理ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用定性?shī)A心免疫檢測(cè)技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國(guó)型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強(qiáng)的肽段，分別來(lái)自于該毒株的開(kāi)放閱讀框2和開(kāi)放閱讀框3。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會(huì)與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會(huì)與第一次孵育結(jié)合上的HEV IgM抗體相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時(shí)會(huì)發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結(jié)合物所形成的復(fù)合物的孔才會(huì)發(fā)生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長(zhǎng): 450nm處測(cè)量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn), O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認(rèn)為是初試陽(yáng)性。（五）操作步驟方法一用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4 過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37 孵育0.51小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37 1030分鐘。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。方法二用于檢測(cè)未知抗體的間接法1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110g/ml，每孔加0.1ml，4過(guò)夜；2.次日洗滌3次；3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37孵育1小時(shí),洗滌；4.（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml；5.37孵育30-60分鐘，洗滌；6.最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。（六）試劑器材試劑（1）包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:NaHCO3 1.59克NaHCO32.93克加蒸餾水至1000ml（2）洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO412H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸餾水至1000ml（3）稀釋液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。（4）終止液（2MH2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。（5）底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M檸檬酸（19.2克/L）24.3ml加蒸餾水50ml。（6）TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml無(wú)水乙醇）0.5ml底物緩沖液（PH5.5）10ml0.75%H2O232l（7）ABTS使用液:ABTS0.5mg底物緩沖液（PH5.5）1ml3%H2O22l（8）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。（9）正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。器材（1）聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50l及100l加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。（3）4冰箱，37孵育箱。（七）注意事項(xiàng)1.做好對(duì)照正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。2.實(shí)驗(yàn)條件的選擇在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.09.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 1824小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10g/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為110g/ml。（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。（八）試劑盒的清洗試驗(yàn)原理試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。自備材料1 蒸餾水。2 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3 振蕩器及磁力攪拌器等。安全性1 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。2 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。3 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。操作注意事項(xiàng)1 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。2 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。3 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。4 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。5 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。6 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。7 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。8 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。9 按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。（九）ELISA的應(yīng)用ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。五、Protocols/Recipes2012-03-29 9:05Protocols/RecipesAbC-Arrays:10x PBS Recipe for 1 liter Dissolve in 800 ml distilled water:o 80 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Klium-klorid, a.r.; MW: 74.56o 14.24 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o 2 g KH2PO4Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidrogn-foszft, a.r.; MW:136.09 Adjust volume to 1 liter with H2O Filtrate through an 0.22um filter and divide in 500ml aliquotes Store at room temperature1x PBS Recipe for 1 liter137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2HPO4, 1.46mM KH2PO4 Dissolve in 800 ml distilled water:o 8 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 0.2 g KCl Reanal, No.:18050-1-01-38, Klium-klorid, a.r.; MW: 74.56o 1.424 g Na2HPO4*2H2O Reanal, No.:08973-1-01-38, di-Ntrium-hidrogn-foszft 2-hidrt, a.r.; MW:177,99o 0.2 g KH2PO4Reanal, No.:17890-01-38, Klium-dihidrogn-foszft, a.r.; MW:136.09 Adjust volume to 1 liter with H2O Filtrate trough an 0.22um filter or sterilize by autoclave Store at room temperaturePBS-Tween for 1 liter0.05% Tween 20, PBS Mix on magnetic stirrer:o 0.5ml Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20)o 1 liter PBSPBS-Tween BSA for 300ml0.05% Tween 20, 5%BSA, 0.05% azide, PBS Mix on magnetic stirrer:o 300ml PBS-Tweeno 15g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 1.5ml Sodium azide (from 10% NaN3stock solution) Filtrate through an 0.45um filter Aliquot 50ml/falcon Store at 4CCa2+Mg2+stock solution for 5ml0.25M Ca2+, 0.07M Mg2+ Dissolve in 5 ml Milli Q water:o 0.1838g CaCl2*2H2O Reanal 11024 MSZ 24161-65 Kalcium-klorid, szrtott MW: 147.02 CaCl2*2H2Oo 0.0712g MgCl2*6H2O Reanal No.: 20281-1-01-38 Magnzium-klorid 6-hidrt MW: 203.30 MgCl2*6H2OCa-Mg-VBS (veronal buffered saline) for 25ml (for serum dilution)2.5mM Ca2+, 0.7mM Mg2+, 0.05% Tween 20, 5%BSA, VBS Mix on magnetic stirrer:o 5ml 5x VBSo 250ul Ca2+Mg2+stock solution 0.25M Ca2+, 0.07M Mg2+o 1.25g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 12.5ul Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 25ml with Milli Q water Filtrate though an 0.45um filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20CMg-EGTA-VBS solution for 10ml (dilute serum 5x with it)2.5mM Mg2+, 6.2mM EGTA, 5%BSA, 0.05% Tween 20, VBS Mix on magnetic stirrer:o 2ml 5x VBSo 310ul 0.2M EGTAo 25ul 1M MgCl2stock solutiono 0.5g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul 10% Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Filtrate though an 0.45um filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20CEDTA-VBS solution for 10ml (dilute serum 5x with it)25mM EDTA, 5%BSA, 0.05% Tween 20, VBS Mix on magnetic stirrer:o 2ml 5x VBSo 500ul 0.5M EDTAo 0.5g BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul 10% Tween 20 Sigma No.:P-1379, Polyoxylethylene-sorbitan monolaurate (Tween 20) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Filtrate though an 0.45um filter Aliquot 1ml/eppendorf Store at -20C0.2M EGTA stock solution for 10ml Mix on magnetic stirrer:o 8ml Milli Q watero 0.7608g EGTAethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N,N-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E-4378 LOT 111K5411 FW 380,4 Adjust to pH8 with 10N NaOH otherwise it wont disolve (be careful EGTA is an acid) Adjust volume to 10ml with Milli Q water Store at 4C1x Veronal buffer (VBS)145mM NaCl, 1,8mM Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na), 3mM 5,5-diethyl barbiture acid (C8H12N2O3), pH7.3 Dilute 5x Veronal buffer with Milli Q water5x Veronal buffer for 500ml (5xVBS)727mM NaCl, 9.12mM Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na), 15.63mM 5,5-diethyl barbiture acid (C8H12N2O3), pH7.3 Make solution A:o 0.94g Na-diethyl-barbiturate (C8H11O3N2Na)5,5-Diathylbarbitursaure. Na-salz Serva 18797; MW:206.2o 21.25 g NaCl Reanal, No.:2464-1-22-38, Ntrium-klorid, Ph. Eur.5; MW:58.44o 300ml Milli Q water Make solution B:o 1.44g 5,5- diethyl barbiture acid 5,5-dietil-barbitursav Reanal 04049; MW:184.2o 100ml Milli Q waterBoil it otherwise it wont dissolve, then cool it down Mix solution A and B set pH to 7.3 with app. 50-70l 10N NaOH Fill up until 500ml with Milli Q water, then store it at +4CELISA:Method Coat ELISA plate with 50ul/well 0.2-10ug/ml protein (purity should be above 3%) in PBS or carbonate buffer for 2h on R/T or O/N in the fridge Wash 3x with PBS-Tween (alternative: following washing incubate in ELISA-blocking buffer for 30min R/T and wash 3x with PBS-Tween) Incubate in PBS-Tween diluted antibody/protein solution for 1h at 37C (ideally after 5h reach the equibrium) Wash 3x with PBS-Tween Develope with TMBo Add 100ul TMB developing solution to wellsFor 1 ELISA plate mix: 11ml TMB buffer 110ul TMB solution 22ul H2O2Hydrogen peroxide 30% solution Sigma H-1009o Add 100ul 2M H2SO4to stop the reactiono Detect absorbance at 450nmCarbonate buffer pH 9.5 for 1 liter (for ELISA coat) Disolve in 1 liter Milli Q water:o 1.6g Na2CO3o 2.9g NaHCO3 Adjust to pH 9.5 Store at R/TELISA blocking-buffer for 10ml0.05% Tween 20, 5%BSA, 0.05% azide, PBS Mix on magnetic stirrer:o 10ml PBS-Tweeno 100mg BSA Sigma, No.:A3059-100G, Albumin, bovine serum, Fraction Vo 50ul Sodium azide (from 10% NaN3stock solution) Store at +4CTMB solution for 1ml10mg/ml TNB in DMSO Disolve in 1ml DMSO Dimethyl sulfoxide, minimum 99.5% GC Sigma D5879-100ml o 10mg TNP 3,3,5,5-tetramethyl-benzidine Sigma T-2885 FW240.3 Store at +4CTMB-buffer for 1 liter0.1M Na-acetate, pH 5.5 Disolve in 950ml Milli Q watero 13.6g Na-acetate Ntrium acett, kristlyvizes CH3COONa*3H2O M:136.08 Reanal 14021 Adjust pH to 5.5 with app. 700ul cc. Acetic acid Ecetsav 96% Reanal 0914-1-08-65 M:60.05 Adjust volume to 1 liter with Milli Q water4M H2SO4for 1 liter Carefully pour 392ml H2SO4Sulphuric acid 96% H2SO4Carlo Erba reagents Code no. 410301 (Reanal 17769) FW 98.078 into 608ml Milli Q water (always pour acide into water)2M H2SO4for 100ml mix 50ml Milli Q water + 50ml 4M H2SO4solutionELISA技術(shù)及相關(guān)問(wèn)題在我們的論壇中有許多，在此作一總結(jié)如下，其中包括了你需要的內(nèi)容:六、ELISA的技術(shù)要點(diǎn)包括三個(gè)方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。一、試劑的制備ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。（一）固相載體可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測(cè)定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是812的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定的最合適的固相載體。除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測(cè)定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測(cè)定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。（二）抗原和抗體在ELISA實(shí)施過(guò)程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。ELISA所用抗原有三個(gè)來(lái)源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對(duì)那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的?？寡宄煞謴?fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，則效果更好。（三）免疫吸附劑固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（最常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用15牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。（四）酶和底物ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。ELISA中最常用的酶為辣根過(guò)氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP催化下列反應(yīng)： 上式中DH2為供氫體，H2O2O為受氫體。HRP對(duì)受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇的過(guò)氧化物和尿素的過(guò)氧化物。后者為固體，作為試劑較H2O2方便。許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS2，2-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)。OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無(wú)此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反應(yīng)如下： HRP的純度用RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度的HRP的RZ3.0。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ可不變而活力降低，故重用酶制劑時(shí)更重要的指標(biāo)為活力。酶活力以單位表示：1min將1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個(gè)單位。在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。反應(yīng)式如下： 在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。除HRP和AP以外，在商品ELISA試劑中應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶和脲酶等。-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-