載體構(gòu)建流程PPT課件

.,1,經(jīng)典載體構(gòu)建流程,.,2,I載體構(gòu)建流程,cDNA,提取mRNA,得到目的基因,RT,PCR,PCR產(chǎn)物純化,酶切目的基因和載體,純化酶切產(chǎn)物,連接,轉(zhuǎn)化,菌落PCR,挑取陽性克隆去測序,測序正確的搖菌提質(zhì)粒,保菌,導(dǎo)入表達宿主測試表達情況,.,3,.,4,提取mRNA,如果可能，實驗室應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū)，離心機、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進行消毒。.操作過程中應(yīng)自始至終佩戴口罩和手套，并經(jīng)常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。操作過程所用器材都要經(jīng)過特殊處理。一次性槍頭、離心管等塑料制品采用連續(xù)滅菌兩次來滅活RNA酶。研缽180，4h。,.,5,RT,由于真核基因是由非編碼的內(nèi)含子將ORF分隔開來的斷裂基因，若以基因組為模板PCR得到的片段克隆進載體，不能在原核細胞剪接內(nèi)含子，也不能在非對象真核細胞中正確剪接表達。所以要克隆真核蛋白基因，需以不含內(nèi)含子的連續(xù)編碼的mRNA為模板。PCR耐熱酶不能直接以mRNA為模板擴增，必須通過逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以cDNA為模板擴增目的基因。根據(jù)不同的目的，可有三類引物選擇,.,6,.,7,PCR得到目的基因,剛開始摸條件時，都會先做一個梯度PCR，選出最適條件。由于此步為獲取正確的目的基因，所以盡量避免PCR的突變格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循環(huán)次數(shù)控制在300cycle左右、引物設(shè)計合理等。,重復(fù)13步2530輪,目的DNA片段擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,.,8,.,9,PCR常出現(xiàn)的問題,1.假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高2.出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶3.什么條帶都沒有,.,10,解決方法,假陽性的原因及解決方法：可能引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。還有就是靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。什么條帶都沒有，其原因可能是少加?xùn)|西，酶已經(jīng)失活了，或退火溫度太高等。解決方法：檢查是否少加?xùn)|西了，換一下酶，降低退火溫度或做個梯度，摸一下條件。,.,11,PCR產(chǎn)物純化,倘若直接對PCR產(chǎn)物進行酶切，體系的雜蛋白、離子等會造成酶切困難或星活性，殘余的聚合酶也會填平粘性末端，造成克隆失敗。所以此步對整個分子克隆都至關(guān)重要，可適當用酚抽提、柱純化，必要的話也可以膠回收。,.,12,酶切目的基因和載體,.,13,酶切注意事項,兩種酶切的條件不同時，分別進行兩次酶切，切完一個純化后再切：溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的。只要其中一種酶需要添加BSA，則應(yīng)在雙酶切反應(yīng)體系中加入BSA。BSA不會影響任何內(nèi)切酶的活性。注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現(xiàn)星號活性，可通過增加反應(yīng)體系的總體積的方法實現(xiàn)這一要求。,.,14,酶切常見問題,.,15,純化酶切產(chǎn)物,通常此步是必要的，可以對比未經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物進行連接后獲得的陽性克隆大大低于膠回收酶切產(chǎn)物連接所得陽性克隆。此步的目的是去除多余的片段，得到單一純化的目的基因與載體骨架，使之連接不受其他序列干擾。另外酶切后純化前，均需熱滅活，以免殘余的限制性內(nèi)切酶干擾后續(xù)連接反應(yīng)，降低陽性率。,.,16,回收前,回收后,酶切目的條帶,酶切載體帶,.,17,連接,催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。PCR產(chǎn)物最好進行切膠回收純化，以去除PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。切膠回收PCR產(chǎn)物時，避免DNA在紫外線下暴露時間過長從而形成嘧啶二聚體，造成PCR產(chǎn)物不能連接。凝膠電泳檢測純化后的PCR產(chǎn)物的濃度，優(yōu)化連接反應(yīng)時插入片段與載體摩爾比例為2:110:1（通常為3:1）。PCR產(chǎn)物及載體應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，否則易造成3末端殘基的丟失。一般連接25度2小時，16或4度過夜。,.,18,.,19,轉(zhuǎn)化,基本步驟：（1）將100l感受態(tài)細胞于冰上解凍。（2）取5l連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。（3）將管放入預(yù)加溫到42的水浴中，熱激90秒?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻12分鐘。（4）每管中加700lLB培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)1小時，進行復(fù)蘇。（5）室溫4,000rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100l培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面。注意：細胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細胞的效率進行調(diào)整。（6）將平板置于室溫直至液體被吸收。（7）倒置平皿，于37培養(yǎng)，1216小時后可出現(xiàn)菌落。,.,20,菌落PCR,此步以適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室批量工作的高效性，通常只需挑半個菌落直接作為模板進行常規(guī)PCR就能初步檢測陽性克隆。初步檢菌的陽性克隆接種提質(zhì)粒，供后續(xù)酶切分析以及測序檢測。,.,21,酶切檢測陽性克隆,將菌檢的陽性克隆所得質(zhì)粒進行酶切分析，獲得預(yù)期條帶的即為陽性克隆。要進一步確認是否有因PCR所帶來的點突變，插入，缺失等改變目的基因的序列，還需要對陽性克隆進行測序。選用的酶通常為設(shè)計引物的兩個酶，因為它能完整切下ORF和載體骨架，可以通過條帶大小以判斷陽性克隆。,.,22,挑取陽性克隆去測序,測序是構(gòu)建載體的最