重組人胰島素和重和生長激素的生產(chǎn)工藝.ppt

重組人胰島素和重組人生長激素生產(chǎn)工藝,2010.4.13,重組人胰島素,定義：胰島素是由胰島細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素的生物合成胰島素合成的控制基因在第11對染色體短臂上。在細胞的細胞核中，胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA從細胞核移向細胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由109個氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除其前肽，生成86個氨基酸組成的長肽鏈胰島素原（Proinsulin）。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的C肽，同時生成胰島素，分泌到細胞外，進入血液循環(huán)中。未經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，生物活性僅有胰島素的10%。結(jié)構(gòu)：胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。,豬胰島素牛胰島素賴脯人胰島素（禮來公司、速效Ins）門冬胰島素（諾和諾德公司、速效Ins）甘精胰島素(安萬特公司、長效Ins),人胰島素原,B30A8;A10;B30B28;B29B28A21;B31;B32,3DStructureofInsulin,胰島素二聚體（dimer）,胰島素六聚體（hexamer）,Ins的性質(zhì),胰島素的功能胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。藥理作用治療糖尿病、消耗性疾病。目前臨床使用的胰島素來源1、動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體。2、半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素。3、重組人胰島素（現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素）：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。,1921年-從動物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。1926年-重結(jié)晶胰島素1930s-傳統(tǒng)中、長效動物胰島素1970s-單峰胰島素和單組分胰島素70年代末-半合成胰島素1982年-采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今-重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。,動物來源的胰島素（28種）,半合成來源的胰島素（5種）,基因重組來源的胰島素（27種）,通化東寶1998年12月研制出中國第一支基因重組胰島素“甘舒霖”甘舒霖R-常規(guī)重組人胰島素注射液甘舒霖N-低精蛋白重組人胰島素注射液甘舒霖30R-30/70混合重組人胰島素注射液（30%常規(guī)重組人胰島素和70%低精蛋白重組人胰島素）深圳科興蘇泌啉-常規(guī)重組人胰島素注射液蘇泌啉恩-低精蛋白重組人胰島素注射液徐州萬邦萬邦林-常規(guī)重組人胰島素注射液萬蘇林豬胰島素制劑,胰島素國內(nèi)主要生產(chǎn)廠家,其他（持有藥品注冊證）-南京新天生物化學制藥有限公司、華西醫(yī)科大學制藥廠、上海第一生化制藥廠、武漢生化制藥廠等,臨床用胰島素分類,普通胰島素：從動物胰臟中提取人胰島素傳統(tǒng)中長效胰島素長效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素,傳統(tǒng)中長效胰島素制劑低精蛋白鋅胰島素：胰島素、魚精蛋白和鋅的結(jié)晶。例：禮來公司，HumulinN(rDNA、大腸桿菌)諾和諾德，NovolinN(rDNA、釀酒酵母)胰島素鋅混懸液：精蛋白鋅胰島素與常規(guī)胰島素的混懸液例：禮來公司，Humulin30/70(30%常規(guī)胰島素，70%精蛋白鋅胰島素)Humulin50/50諾和諾德，Novolin30/70Novolin50/50缺陷：作用時間少于24小時作用峰值明顯，夜間低血糖危險性高吸收不穩(wěn)定結(jié)霜現(xiàn)象，由于溫度過冷或過熱導致胰島素再玻璃瓶壁沉淀，喪失活性,速效胰島素,特點：起效快，皮下注射后15分鐘起效。達峰快，注射后15分鐘起效，3060分鐘達到藥效高峰。藥效維持時間短，大約在3小時左右（24小時）。,藥代動力學特點與進餐后人體內(nèi)源性胰島素分泌十分相似，能夠很好地控制當餐后血糖而且不容易發(fā)生低血糖。,Lispro（賴脯胰島素，Humalog）是第一個用于臨床的速效胰島素類似物,由美國禮來公司研制生產(chǎn)，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對換。,Aspart（門冬胰島素，Novolog）由丹麥諾和諾德公司研制生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與人胰島素的區(qū)別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。,APIDRA（賴谷胰島素，Apidra）安萬特公司研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴氨酸。,長效胰島素-人胰島素類似物,1.甘精胰島素（glargine）：商品名Lantus-甘氨酸替代胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩個精氨酸。使胰島素結(jié)合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點，使等電點由5.4上升至中性。這樣，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結(jié)晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir-胰島素B鏈29位賴氨酸側(cè)鏈通過酰基化連接一個N-16-烷基酸的14碳游離脂肪酸該游離脂肪酸能與白蛋白結(jié)合，延緩與胰島素受體結(jié)合，從而延長其半衰期。,InsulinDetemir（Levemir）諾和諾德公司研制,glargine（Lantus）安萬特公司研制,胰島素肺部吸入制劑-Exubera,輝瑞、萬安特以及Nektar共同研發(fā)于2006.1.27被FDA批準一種作用快的胰島素干粉吸入劑適用于餐前給藥，其胰島素吸收具有速效化的特征,胰島素制備工藝,重組DNA技術(shù)制造人胰島素,AB鏈合成法：以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融和基因，分別在大腸桿菌中表達A鏈和B鏈，然后再通過化學氧化作用，通過二硫鍵連接起來。已被淘汰反轉(zhuǎn)錄酶法：仿照天然合成途徑通過胰島素原的cDNA合成，表達產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具酶切開，除去C-肽得人胰島素。,InsA鏈,InsB鏈,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,發(fā)酵,A鏈,B鏈,純化,二硫鍵,活性胰島素,AB鏈合成人胰島素,反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島素,破碎菌體包含體尿素溶解復性,酵母系統(tǒng)生產(chǎn)重組胰島素,優(yōu)點：二硫鍵的結(jié)構(gòu)與位置正確，不需要復性加工處理缺點：表達低，發(fā)酵時間長表達載體結(jié)構(gòu)基因組