藥品質(zhì)量標準分析方法驗證

化學藥品質(zhì)量標準分析方法驗證,河南省食品藥品檢驗所聞京偉2005年6月,藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則收載于中國藥典2000年版二部與2005年版二部附錄化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術指導原則國食藥監(jiān)注2005106號關于發(fā)布化學藥物穩(wěn)定性研究等16個技術指導原則的通知二五年三月十八日發(fā)布,方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用，并成為質(zhì)量研究和質(zhì)量控制的組成部分。只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于控制藥品質(zhì)量，因此方法驗證是制訂質(zhì)量標準的基礎。方法驗證是藥物研究過程中的重要內(nèi)容。,藥品質(zhì)量標準分析方法驗證的目的,是判斷采用的分析方法是否科學、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。從本質(zhì)上講，方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內(nèi)容，并通過設計合理的試驗來驗證所采用的分析方法能否符合檢測項目的要求。,在下述情況下，分析方法需經(jīng)驗證,1、建立藥品質(zhì)量標準；2、藥品生產(chǎn)工藝變更；3、制劑的組分變更；4、對原分析方法進行修訂時。方法驗證理由、過程和結(jié)果均應記載在藥品標準起草說明或修訂說明中。,需驗證檢測項目的分類,根據(jù)檢測項目的設定目的和驗證內(nèi)容的不同要求，可將需驗證的檢測項目分為四類：1、鑒別鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質(zhì)，用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性。,需驗證檢測項目的分類,2、雜質(zhì)檢查（限度試驗、定量試驗）雜質(zhì)檢查主要用于控制主成分以外的雜質(zhì)，如有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)等。雜質(zhì)檢查又可分為限度試驗和定量試驗兩種情況。用于限度試驗的分析方法驗證側(cè)重專屬性和檢測限。用于定量試驗的分析方法驗證強調(diào)專屬性、準確度和定量限。,需驗證檢測項目的分類,3、定量測定定量測定包括含量測定、制劑的溶出度（釋放度）測定等，由于此類項目對準確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性。,需驗證檢測項目的分類,4、其他特定檢測項目。其他特定檢測項目包括粒徑分布、旋光度、分子量分布等，由于這些檢測項目的要求與鑒別、雜質(zhì)檢查、定量測定等有所不同，對于這些項目的分析方法驗證應有不同的要求。,驗證內(nèi)容,1、準確度；2、精密度（包括重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）；3、專屬性；4、檢測限；5、定量限；6、線性；7、范圍；8、耐用性。,一、準確度,準確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或認可的參考值接近的程度。一定的準確度為定量測定的必要條件，因此涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證準確度，如含量測定、雜質(zhì)定量試驗等。對于制劑一般以回收率試驗來進行驗證。準確度應在規(guī)定的范圍內(nèi)測試。,一、準確度,1含量測定方法的準確度原料藥可用已知純度的對照品或樣品進行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準確度的另一個方法測定的結(jié)果進行比較。,一、準確度,1含量測定方法的準確度制劑可用含已知量被測物的各組分混合物進行測定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準確度的另一個方法測定結(jié)果進行比較。,一、準確度,2雜質(zhì)定量測定的準確度可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進行測定。如不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進行比較，如藥典標準方法或經(jīng)過驗證的方法。在不能測得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的響應因子或?qū)υ纤幍南鄬憫蜃忧闆r下，可在線測定雜質(zhì)的相關數(shù)據(jù)，如采用二極管陣列檢測器測定紫外光譜，當雜質(zhì)的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料藥的響應因子近似計算雜質(zhì)含量（自身對照法）。應明確表明單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當于主成分的重量比（%）或面積比（%）。,一、準確度,3數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9個測定結(jié)果進行評價，例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。應報告已知加入量的回收率（%），或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。用于藥品的含量測定時，樣品濃度應設定于含量100的20之間；用于溶出（釋放）曲線考察時，樣品濃度應設定于全曲線范圍的上、中、下部位。,二、精密度,精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。精密度包括：重復性、中間精密度和重現(xiàn)性。含量測定和雜質(zhì)的定量測定應考慮方法的精密度。,二、精密度,1重復性在相同條件下，由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復性；在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9個測定結(jié)果進行評價，例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試溶液，進行測定?；?00%的濃度水平，用至少測定6次的結(jié)果進行評價。,二、精密度,2中間精密度在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；為考察隨機變動因素對精密度的影響，應設計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備。,二、精密度,3重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。當分析方法將被法定標準采用，應進行重現(xiàn)性試驗。應注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質(zhì)量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。,三、專屬性,專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。鑒別反應、雜質(zhì)檢查、含量測定方法、有機溶劑殘留量測定等均應考察其專屬性。如方法不夠?qū)?，應采用多個方法予以補充。,三、專屬性,1鑒別反應應能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構相似化合物區(qū)分。需確證含被分析物的供試品呈正反應，而不含被測成分的陰性對照呈負反應，結(jié)構相似或組分中的有關化合物也應呈負反應。,三、專屬性,2雜質(zhì)檢查作為純度檢查，所采用的分析方法應確?？蓹z出被分析物中雜質(zhì)的含量，如有關物質(zhì)、重金屬、有機溶劑等。因此雜質(zhì)檢查要求分析方法有一定的專屬性。在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具適當?shù)臏蚀_度與精密度。,三、專屬性,2雜質(zhì)檢查在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專屬性可通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同、或具較強分辨能力的方法進行結(jié)果比較來確定?；?qū)⒐┰嚻酚脧姽庹丈?，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化的方法進行破壞（制劑應考慮輔料的影響），比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個數(shù)和量。必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進行色譜峰純度檢查。,三、專屬性,3、含量測定含量測定目的是得到供試品中被分析物的含量或效價的準確結(jié)果。在雜質(zhì)可獲得的情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的供試品比較測定結(jié)果。,三、專屬性,3、含量測定在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可采用另一個經(jīng)驗證了的或藥典方法進行比較，對比兩種方法測定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗（強光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化），得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進行含量測定，比較測定結(jié)果。必要時進行色譜峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。,三、專屬性,2含量測定和雜質(zhì)測定在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進行測定，與另一個經(jīng)驗證了的或藥典方法比較結(jié)果。用強光照射，高溫，高濕，酸、堿水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑。含量測定方法應比對二法的結(jié)果，雜質(zhì)檢查應比對檢出的雜質(zhì)個數(shù)，必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進行峰純度檢查。,三、專屬性,專屬性驗證常見主要問題驗證方法不科學。主要是破壞性試驗條件選擇不合理，往往出現(xiàn)破壞條件太劇烈或使用破壞條件無效。破壞條件選擇參考標準：能出現(xiàn)雜質(zhì)峰，主成分峰的峰面積約相當于破壞前的8090，并能與產(chǎn)生的雜質(zhì)峰很好的分離。,四、檢測限,檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。該驗證指標的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質(zhì)限度試驗，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。藥品的鑒別試驗和雜質(zhì)檢查方法，均應通過測試確定方法的檢測限。常用的方法如下。,四、檢測限,1非儀器分析目視法（直觀法）檢測限的測定是通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行分析，并以能準確、可靠檢測被測物的最小量或最低濃度來建立。用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。,四、檢測限,2信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與噪聲信號進行比較，計算可檢出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。其他方法有基于工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。無論用何種方法，均應用一定數(shù)量的試樣，其濃度為近于或等于檢測限，進行分析，以可靠地測定檢測限。,五、定量限,定量限系指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應具一定準確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準確測出。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量測定方法研究時，應確定方法的定量限。常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為101時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。,五、定量限,1、直觀法直觀評價可以用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法。定量限一般通過對一系列含有已知濃度被測物的試樣進行分析，在準確度和精密度都符合要求的情況下，來確定被測物能被定量的最小量。,五、定量限,2、信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與噪聲信號進行比較，計算出可檢出的最低濃度或量。一般可信噪比為10：1。其他方法有基于工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。無論用何種方法，均應用一定數(shù)量的試樣，其濃度為近于或等于定量限，進行分析，以可靠地測定定量限。,六、線性,線性系指在設計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。應在規(guī)定的范圍內(nèi)測定線性關系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進行測定，至少制備5份供試樣品。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經(jīng)數(shù)學轉(zhuǎn)換，再進行線性回歸計算。,七、范圍,范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應根據(jù)劑型和分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結(jié)果和要求確定。1、原料藥和制劑含量測定，范圍應為測試濃度的80%120%；,七、范圍,2、制劑含量均勻度檢查，范圍應為測試濃度的70%130%；3、溶出度的溶出量測定，范圍應為限度的20%，4、釋放度中如規(guī)定了限度范圍，則應為下限的-20%至上限的20%；5、雜質(zhì)測定范圍應根據(jù)初步實測，擬訂為規(guī)定限度的20%。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時用百分歸一化法，則線性范圍應為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限）的20%。,八、耐用性,耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為把方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。耐用性主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。,八、耐用性,典型的變動因素有：1、被測溶液的穩(wěn)定性，樣品的提取次數(shù)、時間等。2、液相色譜法中，流動相的組成和pH值，不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱溫，流速等。,八、耐用性,3、氣相色譜法，不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，不同類型的擔體，柱溫，進樣口和檢測器溫度等。經(jīng)試驗，應說明小的變動能否通過設計的系統(tǒng)適用性試驗，以確保方法有效。,附表檢驗項目和驗證內(nèi)容,方法再驗證,在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行全面或部分驗證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗證。再驗證原則：根據(jù)改變的程度進行相應的再驗證。,方法再驗證,當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定應無干擾。,方法再驗證,當制劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要對鑒別、含量測定方法再驗證。當原料藥產(chǎn)地來源發(fā)生變更時，可能會影響雜質(zhì)檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此需要對雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法進行再驗證。,方法再驗證,當質(zhì)量標準中某一項目分析方法發(fā)生部分改變時，如采用高效液相色譜法測定含量時，檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，證明修訂后分析方法的合理性、可行性。,方法再驗證,已有國家標準的藥品質(zhì)量研究中，基于申報的原料藥合成工藝、制劑處方中的輔料等一般無法保證與已上市藥品的一致性，需對質(zhì)量標準中部分項目進行方法的再驗證。方法再驗證是對分析方法的完善過程，應根據(jù)實際改變情況進行再驗證，從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。,有關方法驗證值得關注的幾個問題,1、并非每個檢測項目的分析方法都需進行所有內(nèi)容的驗證，但同時也要注意驗證內(nèi)容應充分，足以證明采用的分析方法的合理性。如雜質(zhì)限度試驗一般需要驗證專屬性和檢測限，而對于精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則一般不需要進行