細(xì)胞凋亡與疾病-高級病生.ppt

1、,何 芳 教 授 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 2013年9月,細(xì)胞凋亡與疾?。ˋpoptosis and disease）, 概述 凋亡時細(xì)胞的主要變化 細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制 細(xì)胞凋亡常用的研究方法 細(xì)胞凋亡與疾病,一.概述 (一)凋亡概念的提出 1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍的組織中脫落并被吞噬，機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念。,apoptosis (細(xì)胞凋亡)：由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡

2、過程稱為細(xì)胞凋亡，又稱programmed cell death,PCD (程序性細(xì)胞死亡),(二)細(xì)胞凋亡的研究歷史,1.1972-1987：細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)研究階段：1）利用光鏡和電鏡對形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)的研究。2）染色體DNA的降解。 3）RNA/蛋白質(zhì)大分子的合成。4）鈣離子變化。 5）內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。,2.細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究階段:1）細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因及調(diào)控2）細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3）細(xì)胞凋亡的各種分子及其相互作用3.細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段,(三)細(xì)胞凋亡生物學(xué)意義 確保正常發(fā)育、生長。 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。 發(fā)揮積極的防御功能。,二.凋亡時細(xì)胞的主要變化 (一

3、)形態(tài)學(xué)改變,正常 細(xì)胞,凋亡小體,吞噬細(xì)胞,壞死,凋亡,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的比較,細(xì)胞間連接喪失； 2）胞體固縮； 3）細(xì)胞器完整； 4）核固縮； 5）染色質(zhì)邊集； 6）凋亡小體形成,1、凋亡的主要形態(tài)學(xué)變化,2、細(xì)胞凋亡與壞死的比較壞 死 凋 亡,誘導(dǎo)因素 強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生 較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生 生化性質(zhì) 病理性，非特異性 生理性或病理性，特異性 特點 被動過程，無新蛋白 主動過程，有新蛋白合成， 合成,不耗能， 耗能 形態(tài)變化 細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、 胞膜及細(xì)胞器相對完整，細(xì) 破壞、細(xì)胞腫脹 胞皺縮，核固縮 DNA電泳 彌散性降解，電泳呈 DNA片段化(180-200bp)，電 均一DNA

4、片狀 泳呈“梯”狀條帶 炎癥反應(yīng) 溶酶體破裂，局部炎 溶酶體相對完整，局部無炎癥 癥反應(yīng) 反應(yīng) 凋亡小體 無 有 基因調(diào)控 無 有,3、 細(xì)胞凋亡、PCD的區(qū)別,特征 PCD 細(xì)胞凋亡 形態(tài)學(xué) 細(xì)胞固縮，裂成小體 同左 膜完整性 保持到晚期 同左 線粒體 常有陣發(fā)的自噬作用 無變化 染色質(zhì) 凝聚，電子致密度加大 著邊 自噬作用 常有，但并非一定發(fā)生 無 潛伏期 幾小時 幾分鐘到幾小時 蛋白質(zhì)合成 放線菌素D及放線菌酮 放線菌素D及放線 阻斷死亡 有時阻斷死亡 胞漿生化變化 溶酶體酶活性有時增加， 溶酶體增加，c-myc, 偶有熱休克蛋白、c-myc， c-fos? c-fos,核DNA電泳 無

5、梯狀DNA 梯狀DNA圖譜 首先的表現(xiàn) 蛋白質(zhì)合成下降，方式改變 內(nèi)源性核酸酶活化,4、細(xì)胞凋亡與脹亡的比較脹亡 凋 亡,早期 細(xì)胞腫脹波及胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 細(xì)胞皺縮、體積縮小、胞漿濃縮 胞漿疏松化并且有空泡形 及出芽改變 成體積增大 形態(tài)變化 胞膜完整性破壞、 胞膜及細(xì)胞器相對完整 細(xì)胞器崩解 DNA電泳 非特異性 DNA片段化(180-200bp)，電 DNA片段 泳呈“梯”狀條帶 炎癥反應(yīng) 周圍明顯炎 溶酶體相對完整，局部無炎癥 癥反應(yīng) 反應(yīng) 凋亡小體 無 有,1997年美國毒理病理學(xué)會細(xì)胞死亡命名委員會將細(xì)胞死亡途徑分為凋亡和脹亡（Oncosis）,(二)細(xì)胞凋亡的生化改變 1.DNA的片段化

6、：判斷凋亡發(fā)生的客觀指標(biāo)之一 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用引起的DNA斷裂產(chǎn)生的單鏈缺口優(yōu)先發(fā)生于核小體連接區(qū)，使DNA斷裂成核小體倍數(shù)大小的片段, 即180-200bp倍數(shù)大小的片段, 在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的階梯狀DNA區(qū)帶。,凋亡早期即發(fā)生； 核小體間連接部位斷裂成180200bp整倍數(shù)片段； 染色質(zhì)DNA單鏈斷裂。,2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用(Ca2+/Mg2+) DNase、DNase (pH=6.2左右） ,Topo 、 Topo （解旋）,（1）caspases 的結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu):caspase成員都具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性，正常時它們都以酶原（30-50KD）形式存

7、在，包括三個結(jié)構(gòu)域：一個N末端原結(jié)構(gòu)域，一個大亞基（20Kd），一個小亞基（10kd）。,3. caspases 激活, 細(xì)胞內(nèi)caspases與其抑制劑總是共存，以免 Caspases酶原被意外激活，對正常細(xì)胞造成損傷,（3）caspases分類： 根據(jù)大小亞單位序列的同源性以及功能: 細(xì)胞因子處理組：1，4，5，11，12，13，14 凋亡起始組：2，8，9，10 凋亡效應(yīng)組： 3，6，7，,(4) caspase的活化:前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。,（5

8、）激活方式： 自活化（autoactivation）:長原結(jié)構(gòu)域(caspases-8,10) 轉(zhuǎn)活化（transactivation）:短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7) 連接調(diào)節(jié)亞單位激活:(caspases-9) 非caspase蛋白酶的活化 （activation by non-caspase proteinases）:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的顆粒酶B(caspase -3,7,8,910 ） ，組織蛋白酶G (caspase -7 ）,Apaf-1,（5）激活方式： 自活化（autoactivation）:長原結(jié)構(gòu)域(caspases-8,10) 轉(zhuǎn)活化（transactivat

9、ion）:短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7) 連接調(diào)節(jié)亞單位激活:(caspases-9) 非caspase蛋白酶的活化 （activation by non-caspase proteinases）:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的顆粒酶B(caspase -3,7,8,910 ） ，組織蛋白酶G (caspase -7 ）,（6）目前已知的Caspase功能有： 滅活凋亡抑制蛋白。 直接作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，裂解核纖層，使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。 分解與細(xì)胞骨架構(gòu)成相關(guān)的蛋白其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal adhesion kinase ,FAK）、P21

10、活化激酶（PAK）等，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組、凋亡。 caspase可使一些與DNA修復(fù)、復(fù)制和mRNA縫結(jié)有關(guān)的蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)解離，瓦解核結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞降解為凋亡小體。,(7)Caspase的抑制劑：,病毒性抑制劑： 1)牛痘病毒蛋白CrmA（cytokine response modifier A）：直接作用于成熟Caspase活性位點 有效抑制Caspase1，4，6，8，對Caspase2，3，7，10效果差 2)P35:以競爭性結(jié)合的方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體,肽類抑制劑：,Ac-DEVD.CHO,AcYVAD.CHO,z-VAD.fmk,Bcl-2蛋白家族：,其他

11、:NO及其相關(guān)分子，鋅,3)桿狀病毒蛋白IAP（inhibitor of apoptosis family protein，7種），不是活性位點特異性抑制劑 4)V-FLIP：包含兩個DED，與Caspase競爭結(jié)合死亡受體復(fù)合物 5)蛋白HBx（乙肝病毒編碼）： Caspase-3,4、大分子合成,(1)細(xì)胞凋亡需要RNA和（或）蛋白質(zhì)的合成，大分子合成抑制劑可阻斷細(xì)胞凋亡； (2)細(xì)胞凋亡發(fā)生前所需生物大分子已存在于細(xì)胞內(nèi)，只是被分割開來或以無活性狀態(tài)存在，其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些離子的存在,除非有活化信號傳入，它們對細(xì)胞并不造成損害，這種情況下細(xì)胞凋亡不受蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑

12、的影響；,(3)細(xì)胞內(nèi)已有凋亡所需的大分子物質(zhì)，只是其功能被其它生物大分子（如bcl-2）的連續(xù)合成所抑制，此時蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 5、鈣離子的動員,內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流途徑,鈣池,Ca2+引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制,線粒體,肌漿網(wǎng),損傷刺激,肌漿Ca2+,鈣蛋白酶,染色質(zhì) 凝集,磷脂酶,磷脂分解,谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶,骨架蛋 白破壞,核酶,染色體 損傷,似秋葉的凋零， 告別生命之輝煌； 那難以計數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)， 輕啟著道道程序， 逼細(xì)胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧處處肆虐， 鈣波濤驚石裂岸， 線粒體把生命之光一點一點擰淡;,危難中的細(xì)胞啊， 你沉穩(wěn)不亂， DNA片片切割， 化

13、云梯直通天堂； 細(xì)胞體分團(tuán)相聚， 把生命的凝重濃集在小體上； 分別了朝夕相處的伙伴， 再見了快樂美好的時光； 這一切的一切又融入臨近的胞體， 騰出的空間再寫生命的篇章。,三.細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控,(一)細(xì)胞凋亡過程,凋亡過程,受體,cAMP Ca2+ 神經(jīng)酰胺,凋亡相關(guān)基因激活,信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞膜,細(xì)胞核,Dnase激活 Caspases激活,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程,凋亡細(xì)胞的清除,Dnase激活,Caspases激活,(二)細(xì) 胞 凋 亡 的 調(diào) 控 1.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與抑制,2.細(xì)胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction) 多樣性 偶聯(lián)性 同一性 多途性,死亡受體是一組

14、TNF受體基因超家族的成員，包括Fas(CD95,Apo1)，TNFR1(P55,CD120a)，死亡受體DR3 、DR4、DR5等。其結(jié)構(gòu)特點為胞外區(qū)有一半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(cystein-rich domain)，胞內(nèi)區(qū)有一死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, DD)。它們是一組膜蛋白，與FADD結(jié)合，而FADD的聚集則通過其死亡效應(yīng)區(qū)(death effect domain,DED)激活caspase-8。,(1)死亡受體途徑,Fas配體(凋亡信號),Fas(DR),細(xì)胞膜,Fas(death domain),FADD(Fas-associated death domain),Casp

15、ase-8,(2)線立體途徑:,(3)以神經(jīng)酰胺為第二信使介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,(4)DAG/PKC系統(tǒng),(5)cAMP /PKA信號系統(tǒng) PKA使關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分子發(fā)生不同程度的磷酸化，進(jìn)而影響內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的活性，在研究糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡時，即發(fā)現(xiàn)cAMP和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)的現(xiàn)象。,(6)胞內(nèi)Ca2+ 信號系統(tǒng),3.凋亡相關(guān)基因 (1)bcl-2及其相關(guān)基因： B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2）， 1984年從濾泡性淋巴瘤發(fā)現(xiàn)，存在于核膜和線粒體。1988年首次證實bcl-2基因的高表達(dá)可引發(fā)腫瘤，bcl-2家族至少有15

16、個成員。 1)抑制凋亡bcl-2亞族：bcl-2、Mcl-1、bcl-w等,存在于線粒體膜上。 抗凋亡的主要機(jī)制是：,直接的抗氧化 抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì) 抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bak的細(xì)胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶(caspases)的激活 維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定,2)促進(jìn)凋亡bax亞族：bax、bak、bad、bik、bid等，存在于線粒體膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Bax與bcl-2相關(guān)蛋白很高的同源性，編碼三個蛋白：Bax-、Bax-和Bax-。bcl-2與Bax的比率不同也可影響細(xì)胞凋亡。 3)Bcl-X： Bcl-XL(241氨基酸):與bcl-2同源性74% Bcl-Xs(178,少63),

17、BCL-2家族成員,P53基因,WtP53 修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,突變的P53,失活的P53,喪失監(jiān)視DNA損傷的功能,射線，毒素,P53蛋白,+,細(xì)胞凋亡,分子警察,促進(jìn)凋亡基因,(Mtp53）,雙向調(diào)控基因,C-myc是一種癌基因，是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因。編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在GF充足時主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。,C-myc,正常細(xì)胞,調(diào)控細(xì)胞凋亡的某些基因間的相互關(guān)系,ICE 、W tp53 細(xì)胞凋亡 ICE,促進(jìn),Bax 、C-myc 、fas,抑制,BcL-2 Mtp53,凋亡,Wtp53,BCL-2 Bax,誘導(dǎo)和抑

18、制 細(xì)胞凋亡基因,四.細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制,(一)氧化損傷在細(xì)胞凋亡中的作用 (二)鈣穩(wěn)態(tài)失衡(calcium dyshomeostasis) (三)線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用,(一)氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是： 氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因。 氧自由基引起的DNA損傷可活化聚ADP核糖 轉(zhuǎn)移酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗。 氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸， 引起脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜的損傷可 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。, 氧化應(yīng)激可激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，也可產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象。 氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細(xì)胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞

19、凋亡。 自由基對線粒體膜損害導(dǎo)致其通透性和膜電位的變化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1，可加速細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。,Bcl-2 ()(),線粒體 PTP開放,Apaf+Cyt.C,Caspase-9酶原 Caspaes-9,m下降,Caspase-3酶原 Caspase-3,Caspase抑制劑 AIF 蛋白質(zhì)水解,無活性核 酸內(nèi)切酶,細(xì)胞凋亡,核酸內(nèi)切 酶激活,DNA斷裂,Ca2+ NO 缺血 缺氧 活性氧,（+）,(),（+）,（+）,（+）,(),（三）線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中的作用,2002年10月7日英國人悉尼布雷諾爾；美國人羅伯特霍

20、維茨和英國人約翰蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。,2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者（圖片來自http:/www.nobel.se/）,細(xì)胞凋亡檢測方法,基于形態(tài)學(xué)觀察的染色法,基于DNA 片斷化的檢測法,膜聯(lián)蛋白檢測法,Caspase酶分析法,流式細(xì)胞儀定量分析法,五.細(xì)胞凋亡常用的研究方法,（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究方法 1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃

21、縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。,2、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。3、透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，

22、細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。,凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（掃描電鏡）,凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（透射電鏡）,壞死細(xì)胞,凋亡細(xì)胞,鑒定細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)常用方法,（二）DNA降解分析 1、DNA ladder:進(jìn)行DNA的凝膠電泳和溴化乙啶染色（瓊脂糖凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA印跡、脈沖場電泳、單細(xì)胞電泳技術(shù)等）,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖 1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h 2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h 3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h 4細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3 h 5細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4 h 6陰性對照 7Marker,2、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucle

23、otidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） 原理：細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測. 3、通過FCM進(jìn)行檢測,（三）酶學(xué)分析研究方法 1、Caspase3活性測定 （1）Western blot 分析Procaspase-3的活化 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。,（2）Caspase-3作用的特異底物( 熒光測定免疫吸附法, FIENT ) 乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酰胺, (Ac-DEVD),設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。而且Caspase3活性的大小與Ac