《氨基酸分析》PPT課件.ppt

1、1,第二章 氨基酸分析,2,氨基酸分析在蛋白質(zhì)化學(xué)和生物技術(shù)研究、臨床診斷和細(xì)胞生理學(xué)研究、營(yíng)養(yǎng)學(xué)與衛(wèi)生保健、培育農(nóng)作物優(yōu)良品種、食品、制藥等領(lǐng)域具有非常重要的意義。,氨基酸分析,3,氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì),氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一類化合物。 組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。其中有八種為人體必需氨基酸。 人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合成，只有靠食物供給的氨基酸。 各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類和數(shù)量都各不相同。,4,氨基酸的分類,1、根據(jù)氨基酸的酸堿性,5,酸性氨基酸,二個(gè)羧基 一個(gè)氨基,天冬氨酸 谷氨酸,堿性氨基酸,一個(gè)羧基 二個(gè)或二個(gè)以上氨基,賴氨酸 精氨酸 組氨酸,中性氨基酸,一個(gè)羧基

2、一個(gè)氨基,實(shí)際水溶液呈弱酸性： 電離能力 COOH NH2,6,2、根據(jù)氨基酸的化學(xué)特性,疏水性：Ala（丙氨酸） Val（纈氨酸） Leu （亮氨酸）Ile（異亮氨酸） Phe（苯丙氨酸） Pro（脯氨酸） Met（蛋氨酸） 帶電：Arg （精氨酸）Lys（賴氨酸） Asp （天冬氨酸）Glu （谷氨酸）(His)組氨酸 極性： Tyr（酪氨酸） Trp（色氨酸）Ser（絲氨酸）Cys（半胱氨酸）Thr（蘇氨酸）Asn（天冬酰胺）Gln （谷氨酰胺）His（組氨酸）特殊：Gly (Pro)甘氨酸 脯氨酸,氨基酸的分類,7,帶電氨基酸,8,極性氨基酸,9,氨基酸的立體化學(xué),由蛋白質(zhì)水解的氨基酸

3、都為-氨基酸，除甘氨酸外，所有- C都為手性碳原子。 天然的氨基酸均為L(zhǎng)-氨基酸,10,氨基酸的理化性質(zhì),1. 溶解度 2. 熔點(diǎn):高 3. 旋光性有旋光性 4. 味感：D-氨基酸大多帶甜味，L-氨基酸有苦、甜、鮮、酸等四種不同味感。,1. 兩性性質(zhì)：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象堿一樣解離； 2. 與甲醛作用： 3. 與2,4-二硝基氟苯作用： 4. 與茚三酮的作用： 5. 與異硫酸苯酯的作用： 6. 與熒光胺的作用： 7. 與5,5-雙硫基-雙(硝基苯甲酸)反應(yīng),11,等電點(diǎn),概念：將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基酸的酸性電離程度與堿性電離程度相等。此時(shí)，氨基酸

4、帶有的正電荷數(shù)目和負(fù)電荷數(shù)目相等，此溶液的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)，用 pI 表示。 在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸的溶解度最小，易沉淀 等電點(diǎn)可用酸堿滴定方法測(cè)定，也可通過(guò)pK值計(jì)算 側(cè)鏈無(wú)解離基團(tuán)時(shí)：pI=(pK1+pK2)/2 側(cè)鏈有解離基團(tuán)時(shí), pI相當(dāng)于氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)pK值和的一半,12,pH = pI,凈電荷為零,在電場(chǎng)中不移動(dòng),pH pI,帶正電荷,在電場(chǎng)中移向負(fù)極,在電場(chǎng)中移向正極,pH pI,帶負(fù)電荷,等電點(diǎn),要使氨基酸達(dá)到等電狀態(tài)： 中性氨基酸： pI pH 7 加堿,13,與茚三酮的顯色反應(yīng),水合茚三酮,CO2,14,藍(lán)紫色化合物,根據(jù)CO2的量或藍(lán)紫色的深淺程度 作

5、為-氨基酸定量分析的依據(jù)。,與茚三酮的顯色反應(yīng),15,氨基酸的定量斑點(diǎn)分析, 大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團(tuán)。因此，氨基酸的分析依賴于衍生化 反應(yīng)。 對(duì)衍生化試劑的要求是反應(yīng)快，并且 產(chǎn)物與試劑本身的光譜性質(zhì)有明顯的差異。 常用的衍生化試劑有2，4-二硝基氟 苯、熒光胺及鄰苯二甲醛等。 根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為顯色劑及熒光衍生化試劑兩大類。,16,斑點(diǎn)顯色分析法, 茚三酮是氨基酸的斑點(diǎn)顯色分析中非常簡(jiǎn)單的衍生化試劑。 它可以與一級(jí)和二級(jí)胺在酸性介質(zhì)中pH（34）加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和藍(lán)-紫色的絡(luò)合物。一級(jí)和二級(jí)胺的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570和440nm。若二者同時(shí)存在，一般在5

6、00 nm處測(cè)定，靈敏度有所降低。,17,另一種常用的顯色反應(yīng)試劑是2，4-二硝基氟苯，它可以與樣品中氨基酸及一級(jí)和二級(jí)胺反應(yīng)，生成黃色絡(luò)合物，檢測(cè)波長(zhǎng)在420nm。該法測(cè)定的是氨基酸的總量。,斑點(diǎn)顯色分析法,18,斑點(diǎn)熒光分析法,熒光胺是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍 生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如 薄層色譜。 鄰苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸熒光分 析的另一種常見(jiàn)的衍生化試劑。,19,色譜方法,離子交換色譜法 反相色譜分析法 柱前衍生氣相色譜法 衍生化毛細(xì)管電泳法,20,離子交換色譜法,離子交換色譜的基本原理是基于帶電荷的陰陽(yáng)離 子與帶相反電荷的離子交換基團(tuán)的相互作用。 氨基酸、肽和蛋

7、白質(zhì)在溶液中帶電荷，可與離子 交換基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用而保留。 其固定相應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和 構(gòu)象完好。,21,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)酸型磺酸化的 聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。 陰離子交換樹(shù)脂：只有在特殊情況下 用于強(qiáng)酸性氨基酸的分析。,離子交換色譜法,22,1、直接檢測(cè)法,離子交換色譜法用于氨基酸分析時(shí)，可在200nm處對(duì)各種氨基酸進(jìn)行直接檢測(cè)，檢出限在110 pmol之間。,23,（1）選擇性差：生物樣品中多種內(nèi)源 性成分在200 nm處均有吸收； （2）背景高：HPIC常用的各種溶劑在 200 nm處也有吸收。,直接檢測(cè)的缺點(diǎn),24,2、

8、柱后衍生化法,衍生化是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的化合物。 大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。 為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或熒光法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。,25,柱后衍生化法的優(yōu)點(diǎn),1、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以直接進(jìn)樣分析； 2、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物無(wú)需分離； 3、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的重現(xiàn)性好； 4、反應(yīng)無(wú)需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時(shí)間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性就不會(huì)受到影響。 5、對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)

9、定性要求低，因?yàn)榉磻?yīng)及檢測(cè)幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。,26,反相色譜分析法,反相色譜法是以表面非極性載體為固定 相，以極性溶劑為流動(dòng) 相的一種液相色譜分離模式。 反相色譜分析法的效率比離子色譜法高； 用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不僅可以提高氨基酸被檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，而且可以提高氨基酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進(jìn)行分離。,27,柱前衍生氣相色譜法,氣相色譜法分析氨基酸具有分離時(shí)間短、 柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。 氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極 性基團(tuán)，需要先對(duì)其衍生化。,28,兩步法是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化， 然后再用各種酸酐將N-（O、S）基團(tuán)乙酰 化。 一步法是用烴基氯甲

10、酰酯在水、醇類和吡 啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成烴基碳 氧酰烴基酯。,衍生化方法,29,毛細(xì)管電泳具有微量、靈敏和柱效高的 特點(diǎn)，適合于氨基酸手性分離和復(fù)雜樣 品中的氨基酸分析。 用于氨基酸分析的毛細(xì)管電泳主要采用 兩種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳。 檢測(cè)方式主要有紫外法和熒光法。,毛細(xì)管電泳法,30,毛細(xì)管電泳法可以進(jìn)行柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化。 柱內(nèi)衍生化要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或 “夾心餅”兩種形式，具有試劑和樣品用量少的 優(yōu)點(diǎn)。 柱后衍生化可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時(shí)其他 化合物對(duì)衍生反應(yīng)的干擾，缺點(diǎn)是柱后反應(yīng)裝 置體積大，會(huì)引起色譜峰變寬而降低分離效果。,毛細(xì)管電泳

11、法,31,氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法,1、顯色分析法 2、熒光法 3、微生物方法 4、酶分析法,32,顯色分析法,有幾種顯色試劑只有當(dāng)干擾物預(yù)先除去后才有定量分析的價(jià)值。 在有些情況下可以通過(guò)改變?cè)噭┑慕M成或反應(yīng)條件以便進(jìn)行某一種氨基酸的選擇性測(cè)定。,33,熒光法,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照 射下會(huì)產(chǎn)生熒光，其它氨基酸與某些有機(jī) 試劑反應(yīng)之后其產(chǎn)物才會(huì)產(chǎn)生熒光。 相對(duì)于顯色法，熒光分析法的選擇性和靈 敏度要好。,34,微生物方法,微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生長(zhǎng)和復(fù)制需要特定氨基酸的存在。 在有限量的氨基酸存在下微生物的生長(zhǎng)將受到限制。利用濁度分析法或測(cè)定乳酸生成量的增加可對(duì)微生物的生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 微生物方法適合于各種生物樣品，可用于大量樣品的批量分析，而且分析耗費(fèi)低。,35,酶分析法,一種酶對(duì)氨基酸某一種異構(gòu)體的特異性可 以用于D或L型氨基酸的測(cè)定。在這一應(yīng)用 中氨基酸氧化酶非常有用。,36,存在的問(wèn)題及發(fā)