生物轉(zhuǎn)化-苯乙醇輔因子NADH-NAD 的檢測(cè)研究

1、-范文最新推薦- 生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇輔因子NADH/NAD+的檢測(cè)研究 摘要：探究酵母搖瓶發(fā)酵過(guò)程中輔因子NADH/NAD+的主要影響因子。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探討各因素對(duì)輔酶提取得率的影響。在此基礎(chǔ)上，采Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)影響酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NADH/NAD+提取得率的因素進(jìn)行篩選，PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,超聲時(shí)間、提取液的加入量和震蕩次數(shù)是影響酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NADH/NAD+提取得率的4個(gè)關(guān)鍵因素。通過(guò)擬合得到響應(yīng)曲面函數(shù)，獲得了最佳的提取條件為：超聲功率：300瓦、超聲時(shí)間：20min、提取液的加入量：3ml、震蕩次數(shù)：10次，在此條件下酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NADH/

2、NAD+的提取得率最高，這表明從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出單因素法、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法，可以很好地優(yōu)化酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NADH/NAD+的提取工藝。4924關(guān)鍵詞：PB設(shè)計(jì)；響應(yīng)面優(yōu)化；NADH/NAD+；超聲波；高效液相色譜Detection of cofactor NADH / NAD + during the process of biotransformation ofproducing 2 – PhenylethanolAbstract ：The research aimed to explore main influencing factors

3、 of extraction NADH / NAD + by yeast in shaking flask fermentation. Single factor test of all kinds of factors for the extraction rate of NADH / NAD + produced by yeast. On this basis, Plackett- Burman (PB) design were applied to screen and optimize influential factors for extraction process of tota

4、l flavonoids . The ultrasonic time, the amount of added extracts, number of shocks, as three key factors, were found to significantly influence the yields of extraction NADH / NAD + by yeast via PB design and the following statistic analysis, With the hybrid design, response surfaces were optimized

5、and response surfaces function was obtained. Three statistically significant parameters were ultrasonic power：300W、ultrasonic time ：20 min、the amount of added extracts：3mL、numbers of shocks：10 times. Under the optimal levels of the extraction conditions the content of NADH / NAD + was the highest. I

6、t can be seen from the experimental results show that Single factor test、Plackett-Burman (PB) design with the response surface methodology can optimize the extraction process of cofactor NADH / NAD + in yeast cells . 致謝251前言1.1國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展2-苯乙醇是具有玫瑰香型的芳香醇，是一種普遍為人們所接受的香料，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中，如在我國(guó)2-苯乙醇大量應(yīng)用于日用化學(xué)和食品工業(yè)

7、中。生產(chǎn)2-苯乙醇的方法有很多，最常見(jiàn)的2-苯乙醇生產(chǎn)途徑有：1）化學(xué)法合成2-苯乙醇，化學(xué)法合成2-苯乙醇主要是以苯乙烯為原料合成2-苯乙醇，首先是將苯乙烯氧化為環(huán)氧苯乙烷，然后環(huán)氧苯乙烷在鉑等催化劑催化下加氫生成2-苯乙醇。2）天然2-苯乙醇的來(lái)源，主要存在于花類和一些植物中，直接從植物的香精油中提取可得到2-苯乙醇。3）生物法合成2-苯乙醇，生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的前體L-苯丙氨酸和苯丙酮酸途徑：在一些酵母細(xì)胞中，2-苯乙醇經(jīng)過(guò)莽草酸途徑形成分枝酸后，分枝酸在變位酶作用下，轉(zhuǎn)變成預(yù)苯酸，經(jīng)過(guò)脫水、脫羧后形成苯丙酮酸；苯丙酮酸脫羧產(chǎn)生苯乙醛，苯乙醛脫氫便生成2-苯乙醇。一般從植物中直接提取的方

8、法價(jià)格昂貴，企業(yè)往往通過(guò)化學(xué)合成的方法得到，雖然價(jià)格低廉但其本身的性質(zhì)使消費(fèi)者避而遠(yuǎn)之。而通過(guò)酵母發(fā)酵生產(chǎn)的2-苯乙醇與天然提取的并無(wú)差別，并且發(fā)酵法產(chǎn)2-苯乙醇成本低廉，操作簡(jiǎn)單正漸漸的被企業(yè)和市場(chǎng)所接納。為了提高2-苯乙醇的含量就要弄清酵母的代謝過(guò)程。其中酵母代謝過(guò)程中有2個(gè)關(guān)鍵的輔酶NADH/NAD+。酵母發(fā)酵代謝網(wǎng)絡(luò)中的2種重要的關(guān)鍵輔因子為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。其中N指的是煙酰胺，A指的是腺嘌呤，D是指的是double。NAD+是氧化態(tài)而NADH則是它的還原態(tài)。生命現(xiàn)象的各種生命活動(dòng)和細(xì)胞的更新，整個(gè)生命結(jié)構(gòu)的維持和平衡都需能

9、量才能順利地進(jìn)行，而NADH/NAD+則是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶，它是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶。NAD+的基本生理功能是維持細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和能量的代謝；NAD+通常出現(xiàn)在細(xì)胞很多新陳代謝反應(yīng)中。它可以被還原，最多攜帶兩個(gè)電子；NAD+同時(shí)也是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。NAD+的分解曾經(jīng)被認(rèn)為是一種非特異的過(guò)程，而現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到NAD+的分解與細(xì)胞內(nèi)外控制細(xì)胞基因表達(dá)的信號(hào)、Ca2+ 的活化、細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。而NADH則在生物體內(nèi)的糖酵解、檸檬酸循環(huán)和光合作用等過(guò)程中，在細(xì)胞內(nèi)起著電子傳遞的重要作用。NADH不僅是一種重要的生化試劑，同時(shí)也能作為一

10、種生化藥物發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞NADH熒光水平持續(xù)下降則能反映細(xì)胞代謝的衰竭同時(shí)也預(yù)示細(xì)胞死亡發(fā)生。NADH用于糖酵解和細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)。在酵母細(xì)胞內(nèi) NAD+和NADH二者可以相互轉(zhuǎn)化，同化或異化的過(guò)程都會(huì)導(dǎo)致NAD+被還原為NADH。為維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，NADH需要被重新氧化。酵母細(xì)胞內(nèi)的 NADH/NAD+的水平在一定程度上能夠決定細(xì)胞內(nèi)的代謝流分布，酵母細(xì)胞內(nèi)的NADH/NAD+水平與細(xì)胞所處環(huán)境的氧化還原狀態(tài)息息相關(guān)。酵母細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例不僅調(diào)節(jié)著氧化還原的平衡，而且是細(xì)胞代謝活性的指標(biāo)，在代謝過(guò)程及控制上有著極為重要的作用。NAD+是糖酵解和

11、TCA循環(huán)的主要?dú)涫荏w，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈傳遞把電子交給氧，同時(shí)NADH再生為NAD+。NAD+主要通過(guò)糖酵解-三羧酸循環(huán)（EMP-TCA）還原生成NADH，后者通過(guò)呼吸電子 傳遞鏈氧化再生為NAD+。所以對(duì)酵母內(nèi)NADH/NAD+的研究對(duì)酵母代謝有極其重要的意義。 NAD+ADP+Pt→NADH+H+ATPNADH+H+1/2O2→NAD+H2O圖1-1 葡萄糖發(fā)酵輔因子代謝流程圖Fig.1-1 flow chart of glucose metabolism fermentation of cofactors在好氧條件下, 微生物以分子氧為最終電子受體,通過(guò)線粒

12、體內(nèi)的電子傳遞鏈將 NADH 氧化為 NAD+, 而在微氧或者厭氧條件下, NADH 的氧化則主要通過(guò)發(fā)酵途徑實(shí)現(xiàn)。與電子傳遞鏈比較, 發(fā)酵途徑氧化 NADH 效率較低, 導(dǎo)致胞內(nèi) NADH/NAD+比率升高。葡萄糖代謝時(shí)直接經(jīng)代謝所產(chǎn)生的ATP是十分的少的，而代謝產(chǎn)生的NADH或FADH2經(jīng)由一個(gè)電子傳遞與氧化磷酸反應(yīng)可產(chǎn)生大量的ATP。NADH 通過(guò)線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈, 利用氧作為最終電子受體,從而產(chǎn)生大量ATP共細(xì)胞生命活動(dòng)所需，與此同時(shí)NADH 通過(guò)自身或所產(chǎn)生的ATP激活或抑制代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控，從而調(diào)控細(xì)胞生命周期。1.3輔因子對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響在許多

13、發(fā)酵體系中經(jīng)常采用調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的辦法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝的改變，為了提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)強(qiáng)度，對(duì)于糖酵解途徑來(lái)說(shuō)，提高其代謝速度的最優(yōu)條件是同時(shí)保證細(xì)胞內(nèi)較低ATP水平和較高的胞內(nèi)NAD+水平。同時(shí)為了在微氧或厭氧條件維持微生物細(xì)胞內(nèi)最佳的 NADH/NAD+比率或?yàn)檫M(jìn)一步調(diào)節(jié)微生物代謝功能, 以促進(jìn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn), 通常采用添加電子受體、改變底物氧化還原狀態(tài)和調(diào)節(jié)環(huán)境條件等策略以實(shí)現(xiàn)對(duì) NADH/NAD+比率的調(diào)節(jié)。葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑（EMP）產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸，并生成丙酮酸，丙酮酸有氧代謝生產(chǎn)NADH，輔因子的還原力用于苯丙氨酸經(jīng)過(guò)艾氏途徑生產(chǎn)苯乙醛，并在苯乙醇脫氫酶的存在

14、下合成苯乙醇；另一方面丙酮酸產(chǎn)生的還原力用于乙醇的生成，兩種代謝途徑形成關(guān)于NADH的競(jìng)爭(zhēng)性需求。因此研究NADH對(duì)于苯乙醇合成過(guò)程的監(jiān)測(cè)，用于調(diào)控代謝過(guò)程的通路。NADH快速氧化成NAD+且維持一定的胞質(zhì)NAD+濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)代謝有著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步提高糖酵解途徑的代謝通量，胞質(zhì)中的NADH必須充分氧化為NAD+以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，以滿足糖酵解需要，以提高產(chǎn)量。 循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司低速離心機(jī)L-530長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司超聲波細(xì)胞粉碎儀SCIENTZ-IIIA寧波新芝生物科技股份有限漩渦震蕩器QL-901海門市其林貝爾儀器

15、制造有限公司2.1.2培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)試劑培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝所需的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型，所以對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，通過(guò)對(duì)酵母代謝的研究和篩選確定酵母發(fā)酵產(chǎn)2-苯乙醇的培養(yǎng)基如表2-2所示：表2-2 培養(yǎng)基配方Table 2-2 medium formula配比含量Mg2SO40.5%K2HPO40.5%L-phe1%NaCl0.1%葡萄糖活性干酵母3%1%2.2方法2.2.1實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)較多因素進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上將對(duì)實(shí)驗(yàn)有顯著影響的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析建立數(shù)學(xué)模型和回歸方程，最終確定最優(yōu)的提取條件。以下是本實(shí)驗(yàn)采用的

16、實(shí)驗(yàn)方法：(1)單因素法單因素法是實(shí)驗(yàn)中只有一個(gè)影響因素，或雖有多個(gè)影響因素，在安排實(shí)驗(yàn)時(shí)，只考慮一個(gè)對(duì)指標(biāo)影響最大的因素，其它因素盡量保持不變的實(shí)驗(yàn)，即為單因素實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)為能夠較明顯的檢查出單個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，但是工作量巨大，話費(fèi)大量的人力物力。本實(shí)驗(yàn)利用單因素法對(duì)輔酶提取過(guò)程產(chǎn)生影響的因素進(jìn)行檢測(cè)，確定他們的影響程度，方便下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。 3.1.1 細(xì)胞破碎法(1）凍融法細(xì)胞破碎凍融法的基本原理為：細(xì)胞的膜脂在若處于低溫下則它的特性會(huì)發(fā)生變化，本來(lái)細(xì)胞的膜脂是很柔的和且流動(dòng)性很強(qiáng)，但在低溫下會(huì)變脆，如果將其再融解那么膜脂就會(huì)破裂，由于時(shí)間較短細(xì)胞自身還未來(lái)得及修復(fù)。若反復(fù)進(jìn)行此過(guò)程

17、，細(xì)胞就會(huì)破裂。凍融法是把待破碎樣品冷至-15到- 20使之凍固，然后緩慢熔化，如此反復(fù)操作，大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可被破碎，胞內(nèi)的產(chǎn)物將被釋放。本實(shí)驗(yàn)的基本流程如下：將接種酵母的培養(yǎng)基于28，220rad的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h后取發(fā)酵液40mL，3000rad/min，離心1min；棄上清液，記錄菌體濕重；用PBS溶液清洗23次，加入2mL提取液（甲醇：水=4:1）混合，將菌體放于-75凍15min，4 16100rad 10min離心收集上清液冷藏，反復(fù)3次后，將上清液用0.22um的有機(jī)相膜過(guò)濾，將待測(cè)液用液相檢測(cè)。(2）漩渦振蕩破胞旋渦混合器是利用偏心旋轉(zhuǎn)使試管等容器中的液體產(chǎn)生渦流，從

18、而達(dá)到使溶液充分混合的目的。該儀器特點(diǎn)是混合速度快、徹底、液體呈旋渦狀能將附在管壁上的試液全部混均。但此法有諸多缺點(diǎn)：（1）細(xì)胞不能充分破碎使得NADH/NAD+不能完全釋放；（2）在振蕩的過(guò)程中由于玻璃珠之間的摩擦產(chǎn)熱而破壞NADH/NAD+。本實(shí)驗(yàn)的基本流程如下：將接種酵母的培養(yǎng)基于28，220rad的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h后取發(fā)酵液40mL，3000rad/min，離心1min；棄上清液，記錄菌體濕重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1）混合，加入等體積的酸洗玻璃珠于旋窩振蕩器上震蕩30s，冰浴30s，反復(fù)10次。將得到的菌懸液于4 12000rad 10min離心收集上清液，將待測(cè)液用液相

19、檢測(cè)。(3）超聲波破胞法碎超聲波破胞法是利用超聲波產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使細(xì)胞破裂。用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液（通常功率為300瓦）能使細(xì)胞急劇震蕩而破裂。此法多適用于微生物材料，其原理可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。同時(shí)超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種的類型等因素有關(guān)。其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。一般超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少，同時(shí)也存在一些問(wèn)題超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，使散熱有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措

20、施，同時(shí)對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用，空化作用是細(xì)胞破壞的直接原因，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。由于輔酶NADH/NAD+對(duì)熱較為敏感，所以在超聲的過(guò)程中將樣品至于冰浴中進(jìn)行。 本實(shí)驗(yàn)的基本流程如下：將接種酵母的培養(yǎng)基于28，220rad的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h后取發(fā)酵液40mL，3000rad/min，離心1min；棄上清液，記錄菌體濕重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1）混合，加等體積的酸洗玻璃珠震蕩均勻后冰浴超聲20min，300w，超1s停2s。震蕩均勻后于4 12000rad 10min離心收集上清液，將待測(cè)液用液相檢測(cè)。3.1.2提取液配比乙醚滲透的機(jī)理是因?yàn)橐颐演^甲醇更易

21、滲透到酵母細(xì)胞壁外側(cè)的甘露聚糖孔隙間，從而改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，在不破碎和溶解細(xì)胞的情況下使得胞內(nèi)物質(zhì)得以釋放所以乙醚和甲醇的含量配比直接影響到細(xì)胞破碎的效果。本實(shí)驗(yàn)的基本流程如下：將接種酵母的培養(yǎng)基于28，220rad的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h后取發(fā)酵液40mL，3000rad/min，離心1min；棄上清液，記錄菌體濕重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1；1:4；4:1）混合，加入等體積的酸洗玻璃珠于旋窩振蕩器上震蕩30s，冰浴30s，反復(fù)10次后將冰浴超聲20min，300w，超1S停2S于4 12000rad 10min離心收集上清液，將待測(cè)液用液相檢測(cè)。3.1.3 超聲功率超聲功率

22、對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH提取得率的影響很大，超聲的功率越大其產(chǎn)生的熱量就越大可能對(duì)輔酶產(chǎn)生影響，但若超聲功率過(guò)小，細(xì)胞破碎不完全，導(dǎo)致輔酶不能釋放，所以對(duì)超聲功率的大小做單因素考察，確定超聲功率對(duì)輔酶的影響程度。本實(shí)驗(yàn)的基本流程如下：將接種酵母的培養(yǎng)基于28，220rad的恒溫?fù)u床培養(yǎng)2h后取發(fā)酵液40mL，3000rad/min，離心1min；棄上清液，記錄菌體濕重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1；）混合，加入等體積的酸洗玻璃珠于旋窩振蕩器上震蕩30s，冰浴30s，反復(fù)10次后將冰浴超聲20min，功率為100w；300w；500w；800w，超1S停2S于4 12000r

23、ad 10min離心收集上清液，將待測(cè)液用液相檢測(cè)。 53053015005/100206305010205001/20573050012001/22420830100205005/10245910530205005/10051010130205001/224201130131015005/102451210101015005/100203.3相應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了提高試驗(yàn)的可靠性，根據(jù)單因素試驗(yàn)和PB 篩選的3個(gè)顯著因素：震蕩次數(shù)、超聲時(shí)間、加入提取液量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，共17組試驗(yàn)，以輔酶含量為響應(yīng)值，確定酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH提取得率的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3-2所示。表3-2

24、 響應(yīng)面試驗(yàn)方案Table 3-2Analysis of response surface analysis序號(hào)震蕩次數(shù)（次）超聲時(shí)間（min）加入提取液量（mL）輔酶含量（umol/L） 實(shí)驗(yàn)采取色譜條件為：進(jìn)樣量5ul，檢測(cè)溫度30，流速：1ml/min，DAD檢測(cè)器波長(zhǎng)：260nm和340nm(NADH在此波長(zhǎng)下有特征吸收）。流動(dòng)相A為：10mM的KH2PO4，10mM的四丁基氫氧化銨和0.25%甲醇；流動(dòng)相B為100mM的KH2PO4，2.8mM的四丁基氫氧化銨和30%甲醇。采用梯度洗脫，洗脫設(shè)置條件為B流動(dòng)相4min內(nèi)由0%到60%，30分鐘達(dá)到75.6%。按色譜條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)

25、驗(yàn)樣品，如圖標(biāo)準(zhǔn)樣品NAD+、NADH的色譜圖和實(shí)驗(yàn)樣品的色譜圖進(jìn)行比較，NAD+、NADH的峰形較好，可準(zhǔn)確測(cè)定其峰面積，并以峰面積進(jìn)行定量分析。通過(guò)出峰時(shí)間可以定性而通過(guò)峰面積可以對(duì)輔酶進(jìn)行定量。圖3-1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.3-1 The chromatogram of Standard sample圖3-2樣品色譜圖Fig3-2 The chromatograms of sample3.4.2 酶循環(huán)法酶循環(huán)法是采用兩種工具酶進(jìn)行的循環(huán)反應(yīng)，使被測(cè)物放大擴(kuò)增，從而提高檢測(cè)靈敏度的酶學(xué)分析方法. 因?yàn)镹ADH有較強(qiáng)熒光。而NAD+的熒光較弱，所以NADH自身熒光信號(hào)的變化能夠反映出細(xì)胞

26、內(nèi)代謝水平的變化，但是細(xì)胞內(nèi)NADH的含量很低，因此其吸收光譜和熒光光譜信號(hào)很弱。由于NAD+參與了生物體內(nèi)300多種酶的氧化還原反應(yīng)，而且采用酶法測(cè)定具有特異性好、檢測(cè)簡(jiǎn)便、反應(yīng)溫和、無(wú)污染、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)。循環(huán)酶測(cè)定方法：即6-磷酸葡萄糖脫氫酶、谷氨酸脫氫酶的催化特性及酶偶聯(lián)反應(yīng)的原理，使反應(yīng)體系中NADP-NADPH 循環(huán)變化，對(duì)循環(huán)中生成大量的6-磷酸葡萄糖酸，用指示酶6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化，檢測(cè)終產(chǎn)物NADPH，從而提高檢出能力。圖3-1 酶循環(huán)熒光法測(cè)定原理圖Fig.3-1 The principle diagram of the enzyme circulation flu

27、orescence spectrometry3.4.3 試劑盒法輔酶（NAD+）包括還原型（NADH）和氧化型（NAD+）兩種類型。NAD代謝包括NAD+的合成與降解、NAD+/NADH的還原與氧化和NAD+磷酸化生成氧化型輔酶（NADP+）。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)NAD+的合成和降解及其產(chǎn)物參與細(xì)胞凋亡、鈣離子穩(wěn)態(tài)和基因表達(dá)的調(diào)控。NAD+主要通過(guò)糖酵解-三羧酸循環(huán)（EMP-TCA）還原生成NADH，后者通過(guò)呼吸電子傳遞鏈氧化再生為NAD+。因此，NADH/NAD+比值是EMP-TCA和呼吸電子傳遞鏈的重要調(diào)控因子。比值高將抑制EMP-TCA，同時(shí)促進(jìn)呼吸電子傳遞鏈；相反，比值低將促進(jìn)EMP-TCA，同

28、時(shí)抑制呼吸電子傳遞鏈?？梢?jiàn)，NADH/NAD+比值與ATP合成和呼吸耗氧量密切相關(guān)。NADH氧化是活性氧（ROS）的主要來(lái)源， 包括沿著呼吸電子傳遞鏈傳遞時(shí)電子滲漏和發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)膜上NADH直接氧化產(chǎn)生的超氧陰離子兩種途徑。此外，NAD+激酶催化的NAD+磷酸化，是輔酶（NADP+）的唯一來(lái)源?？傊?，NAD+代謝與能量代謝、ROS代謝、NADP+代謝密切相關(guān)，而且在細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞和基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，已經(jīng)成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。 4結(jié)果與分析4.1單因素結(jié)果分析4.1.1 細(xì)胞破碎法通過(guò)單因素法考察不同的細(xì)胞破碎法：反復(fù)凍融法、漩渦振蕩法、超聲波破胞法和有機(jī)溶劑提取法對(duì)酵母細(xì)

29、胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH提取得率的影響。初步篩選對(duì)輔酶提取過(guò)程有影響的因素以便為下一步的實(shí)驗(yàn)打基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-1所示。圖4-1 各細(xì)胞破胞法對(duì)輔酶提取得率的影響Fig.4-1Effect of each cell discruption on the yield of total cofactor通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融法、漩渦振蕩破胞法、超聲波破胞法和有機(jī)溶劑提取法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，得出的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行結(jié)果的分析，結(jié)果如圖4-1所示，超聲波破胞法和有機(jī)溶劑提取法提取輔酶（NADH+NAD+）的得率最高，相對(duì)而言反復(fù)凍融法與漩渦振蕩破胞法的提取得率較低。如圖中誤差棒所示

30、，a與b表示差異性顯著即反復(fù)凍融、振蕩法漩渦振蕩破胞法與超聲波破胞法、有機(jī)溶劑提取法的差異性顯著。而他們彼此之間的差異性不顯著。在方法的選擇上要結(jié)合實(shí)驗(yàn)本身的特點(diǎn)和各細(xì)胞破碎法的優(yōu)缺點(diǎn)。細(xì)胞破碎法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：(1）漩渦振蕩破胞缺點(diǎn)：（1）細(xì)胞不能充分破碎使得NADH/NAD+不能完全釋放；（2）在振蕩的過(guò)程中由于玻璃珠間的摩擦產(chǎn)熱而破壞NADH/NAD+。(2）超生波破胞法用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，通常功率為300瓦使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，其原理可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。同時(shí)超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類型等因素有關(guān)。其特點(diǎn)是操

31、作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。但也存在有問(wèn)題一般在超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。空化作用是細(xì)胞破壞的直接原因，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。 圖4-2 提取液的配比（甲醇：乙醚）對(duì)輔酶提取得率的影響Fig.4-2Effect of extracts （Methanol：Ether）on the yield of total cofactor由圖4-2可知通過(guò)對(duì)甲醇乙醚的配

32、比含量的不同根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得甲醇與乙醚的提取液配比1:1時(shí)具有較高的提取效率，可能與甲醇和乙醚關(guān)于細(xì)胞的滲透壓有關(guān)系。如圖4-2所示，隨著化學(xué)滲透劑甲醇用量的減少輔酶的釋出率明顯增加可能的原因是乙醚對(duì)增加細(xì)胞膜的通透性有較好的效果，但大量的甲醇可能影響了乙醚與菌體的接觸面積導(dǎo)致輔酶不能被徹底的釋放到胞外；但是如增加乙醚的量，輔酶的釋出率明顯減少，可能的原因是當(dāng)乙醚的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)甲醇的量時(shí)在離心的過(guò)程中兩者會(huì)分層，互不相容導(dǎo)致輔酶含量分布不均勻，進(jìn)入液相檢測(cè)時(shí)抽取液體中輔酶含量不勻?qū)е潞拷档?。所以?shí)驗(yàn)選取甲醇：乙醚=1:1的提取液用于有機(jī)溶劑破胞法。4.1.3 超聲功率超聲功率的強(qiáng)弱與產(chǎn)熱的大小密

33、切相關(guān)，超聲的公率越大，產(chǎn)生的熱量就越多；反之超聲的功率小產(chǎn)的熱量相對(duì)較少。所以對(duì)超聲功率的大小做單因素實(shí)驗(yàn)是相當(dāng)有必要的，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定對(duì)酵母內(nèi)輔因子影響最小的功率。對(duì)超聲功率的大小進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下圖4-3所示：圖4-3 超聲功率對(duì)輔酶提取得率的影響Fig.4-3Effect of ultrasonic power on the yield of total cofactor由圖4-3可知，隨著超聲波提取時(shí)間的增加，酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH提取得率先穩(wěn)步上升而后有所下降，在提取300w其含量最高。在一定范圍內(nèi)，超聲功率越大則其得率就越高；但若超聲功率過(guò)大輔酶的含量會(huì)明顯的減少

34、，可能的原因是超聲功率過(guò)大則會(huì)產(chǎn)生大量的熱，既是全過(guò)程都在冰欲中進(jìn)行但是過(guò)大的超生功率瞬間產(chǎn)生巨大的熱量，不可能及時(shí)的散發(fā)熱量，那么酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH就會(huì)失活，其被檢測(cè)的含量隨之下降；若超聲功率過(guò)低則酵母不能完全破碎，細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH也不能完全釋放，那么所檢測(cè)到的輔因子的含量也會(huì)降低。所以本試驗(yàn)選擇超聲波提取功率為300w。使酵母細(xì)胞內(nèi)輔因子NAD+、NADH得以充分釋放。 PB實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表4-1，關(guān)鍵因素的選擇是采用Design expert8.0.5進(jìn)行對(duì)PB設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并進(jìn)行逐步回歸分析，得到回歸分析方程為：輔酶總含量=6.10834-1.324

35、42*B+0.43977*D+0.40958*E?；貧w分析顯著性分析，總體顯著性分析為差異性顯著。當(dāng)Prob > F<0.05時(shí)說(shuō)明因素影響顯著, Prob > F<0.01 說(shuō)明影響高度顯著。從表4-1可以看出提取液的加入量（B）、震蕩次數(shù)（D）這 2 個(gè)因素的Prob > F均小于0.05所以對(duì)酵母內(nèi)輔因子NADH/NAD+的提取率影響顯著,而超聲時(shí)間（E）的Prob > F<0.01則對(duì)酵母內(nèi)輔因子NADH/NAD+的提取率影響高度顯著。因此選擇提取液加入量、震蕩次數(shù)和超聲時(shí)間作為顯著因素，進(jìn)行進(jìn)一步響應(yīng)面的設(shè)計(jì)和分析。4.3響應(yīng)面結(jié)果分析將響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表4-2，對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，模型表達(dá)式如式(1)所示。表4-2 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3The si