基因工程期末考試重點(diǎn)知識(shí)整理

1、基因工程第一章 基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技術(shù)路線(xiàn)PPT)基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遺傳工程,它是用人為方法將大分子(DNA)提取出來(lái),在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后,把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái),然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中,以讓外源遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶(hù)”,進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá),從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù).2、基因工程的歷史基因工程準(zhǔn)備階段：1972，第一個(gè)重組DNA分子的構(gòu)建，構(gòu)建人：Paul Berg及其同事PPT基因工程誕生：1973，Cohen & Boyer首次完成重組質(zhì)粒DNA對(duì)大

2、腸桿菌的轉(zhuǎn)化基因工程發(fā)展階段的幾個(gè)重要事件：一系列新的基因工程操作技術(shù)的出現(xiàn)；各種表達(dá)克隆載體的成功構(gòu)建；一系列轉(zhuǎn)基因菌株、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等的出現(xiàn)3、基因工程的內(nèi)容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因組文庫(kù)(鳥(niǎo)槍法)+分子雜交篩選)第二章 分子克隆工具酶5、限制性核酸內(nèi)切酶的概念、特點(diǎn)、命名、分類(lèi)(問(wèn)答)概念：一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶，主要存在于細(xì)菌體內(nèi)特點(diǎn)（參加PPT）命名： 依次取宿主屬名第一字母，種名頭兩個(gè)字母，菌株號(hào)，然后加上序號(hào)。如：從Haemophilus influenze Rd中提取到的第三種限制型

3、核酸內(nèi)切酶被命名為Hind ，Hin指來(lái)源于流感嗜血桿菌，d表示來(lái)菌株Rd，表示序號(hào)。分類(lèi)：依據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類(lèi)以及是否需要輔助因子可分為：型酶、型（s型）酶和型酶。真核細(xì)胞中有4中DNA聚合酶：，線(xiàn)粒體DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：，6、幾個(gè)基本概念粘性末端：兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置是交錯(cuò)的，對(duì)稱(chēng)地分布在識(shí)別序列中心位置兩側(cè)，這樣形成的DNA片段末端稱(chēng)為。平末端：兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置處在識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這樣切割的結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的，稱(chēng)之為。同裂酶：一些來(lái)源不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有相同的識(shí)別序列。如： BamHI和

4、BstI均可識(shí)別GGATCC。同尾酶：有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不同，但是切割DNA分子產(chǎn)生相同的DNA末端。如： TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC星星活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來(lái)的識(shí)別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱(chēng)為Star活性。DNA物理圖譜：（多為質(zhì)粒圖譜）7、大腸桿菌中甲基化酶的種類(lèi)Dam甲基化酶，在序列GATC中A的N6位置引入甲基。Dcm甲基化酶 ，dcm基因表達(dá)胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識(shí)別DNA雙鏈上的CCA(T)GG序列，并使第二個(gè)C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相關(guān)限制酶的切斷。dcm基因的變異導(dǎo)致胞嘧啶

5、甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。EcoKI甲基化酶；SssI甲基化酶8、依賴(lài)于甲基化的限制系統(tǒng)（McrA,McrBC,Mrr）依賴(lài)于甲基化的內(nèi)切酶E.coli中至少有3種依賴(lài)于甲基化的限制系統(tǒng)mcrA基因表達(dá)E.coli防御體系中起重要作用的McrA酶，該酶能特異性地作用于外來(lái)DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特異序列，使之分解，對(duì)大腸桿菌本身起保護(hù)作用。mcrA基因的變異，導(dǎo)致上述功能缺失，對(duì)外來(lái)DNA中被甲基化的胞嘧啶特異序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆體的穩(wěn)定。mcrB, C基因表達(dá)McrB和McrC兩種特異性蛋

6、白，它們?cè)贓.coli的防御系統(tǒng)中起重要作用。一般情況下，只有這兩種蛋白同時(shí)存在時(shí)才表現(xiàn)出活性，McrC具有識(shí)別和調(diào)節(jié)功能，它能特異性的結(jié)合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特異序列G5mC上，然后由McrB蛋白切斷（McrB蛋白是特異性切斷外來(lái)DNA中G5mC序列的限制性核酸內(nèi)切酶)，防御外來(lái)DNA的侵入。mrr基因是大腸桿菌細(xì)胞防御系統(tǒng)中重要的基因之一，它能?chē)?yán)格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆體。9、幾個(gè)基本概念DNA聚合酶，以單鏈DNA為復(fù)制模板，由5端開(kāi)始復(fù)制到3端的酶。催化DNA的合成（具備模板、引物、dNTP等）及其相輔的活性。反轉(zhuǎn)

7、錄酶，依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶,有5-3合成DNA活性,無(wú)3-5外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯鍵，剪斷mRNA，cDNA第二條鏈合成）。來(lái)自AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)RNA聚合酶，識(shí)別DNA中啟動(dòng)子特異序列，合成RNA，無(wú)需引物。連接酶T4 DNA連接酶，反應(yīng)底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA大腸桿菌DNA連接酶，活性與T4連接酶相似，但需煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的參與，與平末端連接效率很低，不連接RNA。Taq DNA連接酶，可連接dsDNA中的缺口間的兩個(gè)寡核苷酸，需NAD+的參與，最適反應(yīng)溫度45-65。（VS Taq

8、DNA聚合酶）T4 RNA連接酶，可使單鏈DNA或RNA之間相互連接，可用于標(biāo)記RNA的3末端，單鏈DNA或RNA的連接、增強(qiáng)T4 DNA連接酶的連接活性以及合成寡核苷酸。T4多核苷酸激酶& 堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶可將ATP的-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5末端。主要用于對(duì)缺乏5磷酸DNA或合成接頭進(jìn)行磷酸化，同時(shí)可對(duì)末端進(jìn)行標(biāo)記。（探針）堿性磷酸酶主要來(lái)源于牛小腸堿性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5磷酸的反應(yīng)，可防止DNA片段自連。第三章 分子克隆載體10、分子克隆載體必須具備的元件 在克隆載體DNA分子合適的位置應(yīng)有1至多個(gè)克隆位點(diǎn)（MCS），供外源DNA片段組入

9、克隆載體DNA分子 克隆載體能攜帶外源DNA片段（基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中能自我復(fù)制，或整合到DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制 克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞。11、表達(dá)載體必須具備的元件克隆載體必備元件+啟動(dòng)子，終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS書(shū)本p86-8712、標(biāo)記基因的種類(lèi)及作用原理選擇標(biāo)記基因：氨芐青霉素抗性基因（ampr）作用機(jī)理：Ampicillin可以抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類(lèi)的活性，即抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成。 ampr編碼一種可分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)

10、的酶，催化-內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。(目的菌落周?chē)霈F(xiàn)散點(diǎn)菌落，即次生菌落，通過(guò)提高氨芐青霉素的濃度和控制培養(yǎng)時(shí)間12h減少次生菌落)四環(huán)素抗性基因（tetr）作用機(jī)理：四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過(guò)程。 tetr編碼一個(gè)由399個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。氯霉素抗性基因（Cmr）作用機(jī)理：氯霉素可與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)的合成。常用的cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，即一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白，在乙酰輔酶A存在時(shí)，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合?？敲顾兀ㄐ旅顾兀┛剐曰蜃饔脵C(jī)理：卡那霉素

11、和新霉素是氨基糖苷類(lèi)抗生素，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)的合成。該基因（kanr/neor）是一種編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，該酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。琥珀突變抑制基因supF 琥珀突變（書(shū)本p41）篩選標(biāo)記基因： -互補(bǔ)（藍(lán)白斑篩選）：現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)E.coli DNA的短區(qū)段，其中含有-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)MCS，它并不破壞讀框，但是可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞，雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片

12、段各自都沒(méi)有酶活性，但它們可融為一體，形成具有酶活性的蛋白，從而實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為。插入失活，某段DNA序列的插入，使得被插入的基因功能喪失功能，從而達(dá)到篩選的目的。藍(lán)白斑篩選：在lacZ編碼區(qū)上游插入一小段DNA片段，不影響-半乳糖苷酶的功能互補(bǔ)。但是，若在該DNA小片段中再插入一個(gè)片段，將不可避免的產(chǎn)生無(wú)互補(bǔ)能力的-半乳糖苷酶片段13、DNA的特點(diǎn)DNA在噬菌體中是線(xiàn)狀，全長(zhǎng)48502bp，左右各有12個(gè)核苷酸組成的5凸出粘性末端（cohesive end），且兩者互補(bǔ)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，粘性末端連接成為環(huán)狀DNA分子，這樣能連接的末端稱(chēng)為cos位點(diǎn)。14、載體的選擇標(biāo)記lacZ基因，在

13、填充片段中帶有-半乳糖苷酶基因片段cI基因失活cI基因：全面抑制并阻斷裂解生長(zhǎng)必須基因的表達(dá)，促進(jìn)-噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)。外源基因插入cI基因中，使E.coli進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)。Spi篩選野生型噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coli中的生長(zhǎng)會(huì)受到限制的表型，稱(chēng)作Spi+，即對(duì)P2噬菌體的干擾敏感。Spi+ :噬菌體不能感染E.coli（P2）Spi- :(red- gam-）噬菌體能感染E.coli（P2） 形成小噬斑宿主：recA+ ；chi位點(diǎn)第四章 人工染色體載體15、人工染色體的種類(lèi)和必備元件（概念PPT，結(jié)構(gòu)，組成，篩選）酵母人工染色體載體YAC、細(xì)菌人工染色體載體、P1載體和P

14、AC載體YAC（yeast artificial chromosome）克隆載體是最早構(gòu)建成功的人工染色體克隆載體，能像染色體一樣在酵母細(xì)胞中正常的復(fù)制。它是以pBR322為骨架建立，帶有pBR322的復(fù)制起點(diǎn)ori和篩選標(biāo)記基因Ampr，另外還加入作為酵母chr.所必須的一些成分：一段控制酵母chr.復(fù)制的自主復(fù)制序列（ARS）；一段來(lái)自酵母chr.的著絲粒序列（能在細(xì)胞分裂過(guò)程中將chr.載體均勻的分配到子細(xì)胞中）；一對(duì)酵母的端粒序列（來(lái)自四膜蟲(chóng)chr.），防止chr.載體與其他chr.相互粘連，并避免在DNA復(fù)制過(guò)程中造成基因的缺失，從而保證了chr.載體在細(xì)胞分裂和遺傳過(guò)程中的相對(duì)獨(dú)立

15、和穩(wěn)定；選擇標(biāo)記TRP1和URA3（酵母Trp和U營(yíng)養(yǎng)缺陷型的野生型等位基因）；克隆位點(diǎn)存在于酵母酪氨酸t(yī)RNA基因赭石突變的校正基因Sup4中。第五章 表達(dá)載體16、表達(dá)載體啟動(dòng)子的種類(lèi)Plac 啟動(dòng)子（誘導(dǎo)型啟動(dòng)子）、Ptac 啟動(dòng)子（誘導(dǎo)型啟動(dòng)子）、T7啟動(dòng)子（T7噬菌體）和PL啟動(dòng)子（噬菌體）17、T7啟動(dòng)子的工作原理（參見(jiàn)PPT圖文）第六章 基因操作中大分子的分離和分析18、質(zhì)粒DNA的提取原理及步驟（實(shí)驗(yàn)）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線(xiàn)性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH介于12.0-12.5這個(gè)狹窄范圍內(nèi)，線(xiàn)性DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性

16、，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的兩條鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速準(zhǔn)確，而線(xiàn)性染色體DNA的兩條鏈彼此已經(jīng)完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。書(shū)本p100-101堿裂解法小量抽提質(zhì)粒(1)將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmol/L EDTA)中,劇烈震蕩;(2)加

17、200l新鮮配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS), 緩和震蕩,水浴5min;(3)加150l預(yù)冷溶液III (50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)緩和震蕩,冰浴5min;(4)4 以12000g離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中(5)向上清中加入等體積酚：氯仿（1：1），反復(fù)混勻，12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中;(6)向上清加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置510min，12000rpm離心5min，棄上清，吸干離心管中的液體;（析出DNA）(7)用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清，

18、自然干燥;（洗出金屬鹽離子）(8)加20l TE緩沖液，其中含有20g/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解(9)凝膠電泳檢測(cè)抽提結(jié)果，剩下的DNA放-20C冰箱保存。19、凝膠電泳檢測(cè)原理、種類(lèi)、過(guò)程、注意事項(xiàng)凝膠電泳的原理：當(dāng)一種分子被置于電場(chǎng)中，它們就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。這種分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的遷移率，它同電場(chǎng)的強(qiáng)度和電泳分子本身攜帶的凈電荷成正比。在電場(chǎng)中，DNA帶有負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。在一定的電場(chǎng)中，DNA分子的泳動(dòng)速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。種類(lèi)：瓊脂糖凝膠電泳（凝膠濃度越大，孔隙越小，越適合小分子，DNA結(jié)構(gòu)，DNA分子量 , V共價(jià)閉環(huán)V線(xiàn)狀V開(kāi)

19、環(huán)狀）、 聚丙烯酰胺凝膠電泳、 脈沖場(chǎng)凝膠電泳20、SDS-PAGE原理、各成分作用原理：SDS-PAGE(分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸)，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑(巰基乙醇、二硫蘇糖醇)能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量

20、成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。各成分作用，聚丙烯酰胺：丙烯酰胺為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCl系統(tǒng)；TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。21、PAGE與瓊脂糖凝膠電泳的區(qū)別（書(shū)本p102-103）檢測(cè)大?。≒AGE分辨率更高）支架（瓊脂糖，丙烯酰胺聚合（隔絕空氣-垂直結(jié)構(gòu)，加促凝劑）垂直與水平結(jié)構(gòu)百度完

21、善.22、分子雜交種類(lèi)、原理、過(guò)程Southern 雜交；Southern 印跡雜交由E. Southern于1977年建立。它根據(jù)毛細(xì)管作用原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)與已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA 探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。過(guò)程：1、酶切；2、電泳/照相；3、變性/中和 變性試劑：0.4M NaOH 中和試劑：0.5M NaOH /1.5M NaCl 或1M Tris （pH7.4）/1.5M NaCl；4、轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移方式：毛細(xì)管 電轉(zhuǎn)移 真空 轉(zhuǎn)移buffer：6SSC（或SSPE）；5、固定 80 2hr，或者UV照射，micr

22、owaveNorthern雜交；主要針對(duì)RNA分子的檢測(cè)，基本步驟與Southern印跡雜交相似，變性試劑不同等，見(jiàn)作業(yè)百度。Western雜交；轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)而不是RNA菌落雜交（菌落原位雜交）：其他分子雜交p109噬菌斑雜交：書(shū)本p109斑點(diǎn)雜交（斑點(diǎn)印跡雜交）：將通過(guò)特殊的加樣裝置將變性的DNA或RNA核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后與核酸探針?lè)肿舆M(jìn)行雜交以檢測(cè)核酸樣品中是否存在特異性DNA或RNA。狹線(xiàn)雜交：23、探針?lè)N類(lèi)同源或部分同源探針、總cDNA探針、特異性cDNA探針、人工合成的寡核苷酸探針24、E.coli 感受態(tài)細(xì)胞制備過(guò)程PPT25、DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法影響

23、轉(zhuǎn)化的因素：DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌主要通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)完成，噬菌體和M13噬菌體感染宿主細(xì)胞時(shí)分別涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染過(guò)程轉(zhuǎn)導(dǎo)，感受態(tài)細(xì)胞，CaCL2轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染:采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，將重組噬菌體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo):通過(guò)噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程。26、重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法電穿孔法、基因槍法、 顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、 花粉管通道法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)27、重組子的篩選方法（一）遺傳表型直接篩選法1）、根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子抗藥性篩選； 插入失活篩選法； 插入表達(dá)篩選法； 顯色互補(bǔ)篩選法2）、營(yíng)養(yǎng)缺陷

24、型檢測(cè)法根據(jù)目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)，篩選含目的基因的克隆子。若目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記或基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。該方法的使用前提是待選擇的目的基因能在受體菌中進(jìn)行表達(dá)。3）、形成噬菌斑篩選法 DNA載體被外源DNA分子插入后，重組 DNA分子大小必須在野生型 DNA長(zhǎng)度的75105%范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒。轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基平板上被裂解形成噬菌斑，而非轉(zhuǎn)化子正常生長(zhǎng)。噬菌斑中的噬菌體即為重組子。（二）依賴(lài)重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法1）、快速裂解菌落鑒定分子大?。ㄙ|(zhì)?？鞕z

25、）此法主要是根據(jù)有外源DNA片段插入的重組質(zhì)粒與載體DNA之間大小 差異來(lái)區(qū)分重組子和非重組子。2）、限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法 通過(guò)快速裂解菌落鑒定分子大小的方法雖可初步篩選到重組子菌落，但卻難以將其中的期望重組子和非期望重組子區(qū)分開(kāi)，因?yàn)橹亟M質(zhì)粒DNA中，質(zhì)粒載體可能會(huì)與一個(gè)以上的外源DNA片段連接重組，而采用限制性核酸內(nèi)切酶分析法不僅可進(jìn)一步篩選鑒定重組子，而且能判斷外源DNA的插入方向及分子質(zhì)量大小等。3）、利用PCR方法篩選重組子 載體DNA分子中，外源DNA插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列多為固定已知，通過(guò)與插入位點(diǎn)兩側(cè)已知序列互補(bǔ)的引物，以從初選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中提取的少量質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行P

26、CR反應(yīng)，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析就能確定是否是重組子菌落。28、RNAi的概念和作用機(jī)制（RNA干擾）RNAi（RNA interference ）是由雙鏈RNA分子在mRNA水平阻斷相應(yīng)基因表達(dá)或使其沉默的過(guò)程。它廣泛存在于生物界，是生物體抵御病毒或其它外來(lái)核酸入侵而保持自身遺傳穩(wěn)定的保護(hù)性機(jī)制。目前在果蠅、真菌、昆蟲(chóng)、植物以及哺乳動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)。RNAi作用機(jī)制：長(zhǎng)鏈dsRNA被切割成20-25nt長(zhǎng)度的片段，即siRNA。siRNA與核酸誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合，作為模板識(shí)別目的mRNA。通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換出正義鏈。雙鏈mRNA被相

27、關(guān)酶切割產(chǎn)生22nt左右的siRNA，后者與RISC結(jié)合，繼續(xù)反復(fù)切割mRNA，從而使基因沉默。29、miRNA的概念和作用機(jī)制 Small RNAs主要包括兩大類(lèi)： miRNAs (microRNAs) siRNAs (short interfering RNAs)miRNAs普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)，影響基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控和個(gè)體發(fā)育，它由非編碼基因轉(zhuǎn)錄物形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來(lái)，長(zhǎng)度22nt左右；成熟miRNA的5端為磷酸基團(tuán)，3端為羥基；表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)序性和組織特異性；無(wú)ORF，多存于間隔區(qū)，進(jìn)化中結(jié)構(gòu)高度保守。第八章 PCR技術(shù)及應(yīng)用30、PCR的概念、基本要素、具體步驟、反應(yīng)體系PC

28、R（polymerase chain reaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟?；疽兀阂?、 dNTP、 耐熱DNA聚合酶、模板DNA具體步驟：變性（denaturation）：9098；退火（annealing）：37 72 ；延伸（extension）：72 。PCR反應(yīng)體系脫氧核苷三磷酸（dNTP），dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP是PCR的原材料，通過(guò)PCR過(guò)程聚合成互補(bǔ)鏈DNA。貯存濃度：2.5mM，使用濃度：200M。使用濃度不當(dāng)會(huì)影響擴(kuò)增的產(chǎn)量、特異性和保

29、真度。緩沖液（buffer）：TAE，TBE，TPE（T-Tris，E-EDTA，A-乙酸，B-硼酸，P-磷酸）PCR標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含10mmol/L Tris*HCL，PH8.3-9.0。作用：緩沖PH，提供部分反映成分。引物（primer），最佳引物使用濃度為0.1 M 1.0 M 之間。引物濃度太低，擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。引物長(zhǎng)度20nt時(shí)：Tm=4（G+C）+2（A+T）引物設(shè)計(jì)要求:p 設(shè)計(jì)的引物的核苷酸序列必須與模板鏈3端的一段核苷酸序列互補(bǔ),且3端必須有游離的-OH基團(tuán)；(從3端開(kāi)始接合模板鏈,PPT上思考題選A，D)p 引物一般由2030個(gè)核苷酸組成，

30、4種核苷酸盡可能隨機(jī)分布，GC含量應(yīng)達(dá)4060%；p 引物中應(yīng)盡量避免回紋序列出現(xiàn)；p 引物中最好含有進(jìn)一步操作中可利用的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列。模板DNA，作為PCR 的靶DNA一般是一個(gè)待擴(kuò)增的特定雙鏈DNA片段，應(yīng)知道其兩端2030bp的核苷酸序列，供設(shè)計(jì)一對(duì)引物之用。PCR的模板是一條單鏈DNA片段，其3端具有與引物雜交的序列。 耐高溫DNA聚合酶31、耐高溫DNA聚合酶的種類(lèi)、各自的特點(diǎn)Taq DNA聚合酶，來(lái)自嗜熱古細(xì)菌Thermus aquaticus。該菌1967年從溫泉中分離，最適生長(zhǎng)溫度70?，F(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為941

31、03，為單分子酶，具較強(qiáng)的53DNA聚合酶活性和較弱的53外切酶活性，缺乏3 5外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75。合成出錯(cuò)幾率8.910-51.110-4。Pwo DNA聚合酶來(lái)自喜溫性古細(xì)菌Pyrococcus woesei。現(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為90103，具較強(qiáng)的53DNA聚合酶活性，兼35外切酶活性。耐熱性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。Tth DNA聚合酶來(lái)自喜溫性真細(xì)菌Thermus thermophilus HB8。具較強(qiáng)的53DNA聚合酶活性，缺乏3 5 外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75。Mg

32、2+存在時(shí)，以DNA為模板合成DNA，Mn2+存在時(shí)，可以RNA為模板合成cDNA，用于RT-PCR系統(tǒng)。 Vent DNA 聚合酶來(lái)自嗜熱高溫球菌Thermococcus litoralis 。相對(duì)分子質(zhì)量85103。100時(shí)該酶半衰期為1.8hr，具有3 5 外切酶校對(duì)活性。合成的準(zhǔn)確度比用Taq DNA 聚合酶高5 15倍。Pfu DNA 聚合酶來(lái)自激烈熱球菌Pyrococcus fariosus。保真度較高。（35外切酶活性）目前錯(cuò)配率最低。KOD DNA 聚合酶特征：具有強(qiáng)力的35核酸外切酶活性，與Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。合成速度比Taq DNA聚合酶快2

33、倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。耐熱性比Taq DNA聚合酶好，在100、1小時(shí)的熱處理后仍可保持約70的活性，故根據(jù)需要可以將熱變性步驟的溫度設(shè)定值提得更高，這對(duì)處理GC含量高的模板等具有特異性高級(jí)結(jié)構(gòu)的樣品非常有利。高保真 DNA 聚合酶Phusion 高保真DNA聚合酶 (Finnzymes )，Phusion采用一種新的蛋白融合技術(shù)，與一種獨(dú)特的雙鏈DNA結(jié)合蛋白融合后，可以和模板更加緊密的結(jié)合，觸發(fā)更為強(qiáng)勁和快速的擴(kuò)增，它甚至可以用于結(jié)合那些最難被結(jié)合的模板, 持續(xù)擴(kuò)增能力（processivity，決定最大擴(kuò)增長(zhǎng)度）是Pfu酶的10倍，Taq酶的2倍。 商用混合 DNA 聚合酶E

34、x Taq DNA聚合酶Ex Taq Hot start DNA聚合酶LA Taq DNA聚合酶LA Taq Hot start DNA聚合酶為了提高擴(kuò)增的保真度或擴(kuò)增較長(zhǎng)DNA片段，將Taq DNA聚合酶的強(qiáng)啟動(dòng)能力和具有35外切酶活性高溫DNA聚合酶的高持續(xù)活性和校正功能結(jié)合起來(lái)，可以達(dá)到很好的效果。32、PCR平臺(tái)期的概念、出現(xiàn)平臺(tái)期的原因平臺(tái)期：出現(xiàn)平臺(tái)期的原因可能有：后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；引物耗盡；dNTP耗盡；產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致dsDNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。33、PCR產(chǎn)物克隆的幾種方式在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)；A/T克隆法；平末端DNA片段的克??；

35、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增34、PCR擴(kuò)增未知片段的幾種方式反向PCR；利用接頭的PCR；熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR35、RACE、DD-PCR、RAPD、AFLP的概念、原理（參見(jiàn)PPT）第九章 DNA序列分析36、兩種不同的測(cè)序方法的基本原理Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法將待測(cè)DNA片段的5端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列5端被標(biāo)記的長(zhǎng)度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)并列點(diǎn)樣的方式用凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧核苷

36、酸（ddNTP）分子的脫氧核糖的3位置的羥基缺失，當(dāng)它與正常核苷酸混合在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，雖然它也能參與DNA合成，但由于其3位置的羥基缺失，使其下面的核苷酸的5磷酸基無(wú)法與之結(jié)合。也就是說(shuō)，一旦雙脫氧核苷酸整和到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。37、序列分析的基本步驟1、模板制備和引物設(shè)計(jì)模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈DNA，必須保證足夠的濃度引物：18-22nt，55-60，盡量避免3個(gè)以上堿基重復(fù)， 盡量減少發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的可能性。2、經(jīng)典測(cè)序方法的反應(yīng)步驟 模板變性 退火 標(biāo)記摻入標(biāo)記：-32PdATP、 -33PdATP、 -35PdATP 末端標(biāo)記：

37、 -32PrATP 延伸 電泳分析和數(shù)據(jù)讀取38、大片段DNA序列測(cè)定的方法通用引物指導(dǎo)未知序列的測(cè)定；引物步移；隨機(jī)克隆測(cè)序；缺失克隆測(cè)序第十章 DNA誘變39、定向進(jìn)化的概念對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，一次突變很難獲得滿(mǎn)意的結(jié)果，通常采用反復(fù)多次誘變和循環(huán)，其目的是獲得滿(mǎn)足人們需要的性能改良的蛋白質(zhì)，又稱(chēng)為試管進(jìn)化。40、隨機(jī)誘變的方法、原理1）錯(cuò)誤摻入突變，在體外DNA擴(kuò)增中，使用具有錯(cuò)配傾向的DNA聚合酶以及反應(yīng)條件，使堿基錯(cuò)誤摻入到新合成的基因中，又稱(chēng)易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶和突變DNA聚合酶error-prone PCR的實(shí)質(zhì)：通過(guò)改變PCR反應(yīng)

38、條件來(lái)調(diào)整PCR反應(yīng)中突變的頻率，降低聚合酶固有的突變序列傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地以一定的頻率摻入到擴(kuò)增的基因中，從而得到隨機(jī)突變的DNA群體，最后用合適的載體克隆突變基因。2）盒式誘變盒式取代誘變；簡(jiǎn)單的盒式取代誘變是通過(guò)限制性酶切除去特定的雙鏈DNA片段，再與含有突變的單一序列雙鏈寡核苷酸連接,得到取代突變，是一種定點(diǎn)誘變。混合寡核苷酸誘變；若用于取代的是含有隨機(jī)突變的混合雙鏈寡核苷酸，則可在限定區(qū)域內(nèi)引入大量的隨機(jī)突變。3）增變菌株的誘變作用概念：與DNA錯(cuò)配校正功能和DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因突變后，細(xì)胞內(nèi)基因的突變頻率大大增加，這樣的菌株叫增變菌株（mutator

39、 strain）。常用增變菌株：E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT)mutD突變?cè)斐蒁NA聚合酶的35外切核酸酶活性缺陷，失去錯(cuò)配堿基的校正功能；mutS突變使DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)失去功能；mutT突變不能水解dGTP的氧化產(chǎn)物8-oxodGTP， 8-羥基鳥(niǎo)嘌呤在復(fù)制時(shí)摻入DNA中，造成突變。4）化學(xué)誘變用化學(xué)誘變劑處理雙鏈DNA片段，將發(fā)生隨機(jī)突變的片段群體克隆到合適的宿主中，構(gòu)建成一個(gè)重組突變體庫(kù)。用適當(dāng)?shù)墓δ芊治隹设b別攜帶突變的重組子。41、體外重組的種類(lèi)、概念、特點(diǎn)DNA洗牌法（DNA shuffling），是通過(guò)對(duì)一組序列相關(guān)DNA序列，經(jīng)過(guò)超聲波處理或

40、在DNaseI的作用下隨機(jī)切成小片段，然后在沒(méi)有引物的情況下，采用有性PCR方法進(jìn)行合成；隨著循環(huán)數(shù)的增加，PCR產(chǎn)物將越來(lái)越接近切割前的目的基因的長(zhǎng)度；最后用基因兩側(cè)的引物合成全長(zhǎng)的基因。（篩選瓶頸）有性PCRDNA shuffling技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對(duì)可操作的靶序列沒(méi)有任何要求，長(zhǎng)度可達(dá)幾十kb;通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片段上序列的信息，簡(jiǎn)化了操作程序；比隨機(jī)突變顯著提高了良性突變的概率。交錯(cuò)延伸重組交錯(cuò)延伸重組是一種簡(jiǎn)化的DN

41、A shuffling技術(shù)。它不是由短片段組裝全長(zhǎng)基因，而是在PCR樣反應(yīng)中將含不同點(diǎn)突變的模板混合，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫（5sec）復(fù)性/延伸反應(yīng)，在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)直到獲得全長(zhǎng)基因片段，重組的程度可通過(guò)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間和溫度來(lái)控制。（控制溫度，退火，延伸時(shí)間）隨機(jī)引發(fā)重組RPR以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝

42、成完整的基因長(zhǎng)度。該法可以用一條DNA單鏈為模板，因此可以直接以cDNA為模板進(jìn)行隨機(jī)引發(fā)重組。42、傳統(tǒng)的定點(diǎn)誘變的方法、原理Kunkel定點(diǎn)誘變法（又稱(chēng)“U”法）（參見(jiàn)PPT）原理：dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，細(xì)胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP，因此細(xì)胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由T占據(jù)的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶尿嘧啶-N-糖基化酶可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基在體外用誘變引物合成的雜合雙鏈DNA在導(dǎo)入正常ung+ dut+菌株后，只有帶有突變位點(diǎn)的新合成鏈和作模板進(jìn)一步復(fù)制，而野生型不能復(fù)制。這樣能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞就帶有突變

43、位點(diǎn)。（插入M13的DNA可以分別回收到兩種形式：dsDNA和ssDNA）位點(diǎn)選擇誘變（參見(jiàn)課本P179）位點(diǎn)選擇誘變法使用了2個(gè)寡核苷酸引物，一個(gè)是用來(lái)引入突變的引物，另一個(gè)是用來(lái)選擇用的。選擇性引物可用來(lái)恢復(fù)有缺陷的抗生素抗性基因，同時(shí)可用來(lái)選擇引入突變的DNA鏈。特點(diǎn)：可正向選擇突變鏈，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用雙良DNA作模板，可進(jìn)行多輪篩選。但需特定載體，即含有一個(gè)有缺陷的抗生素抗性基因。轉(zhuǎn)化子誘變（參見(jiàn)課本180）轉(zhuǎn)化子誘變也使用了2個(gè)寡核苷酸引物，除了突變引物外，還使用了1個(gè)用來(lái)剔除單一酶切位點(diǎn)的引物。因此該方法也稱(chēng)酶切位點(diǎn)剔除法。將待突變的DNA片段裝載到

44、克隆載體上，該載體上必須存在1個(gè)單一酶切位點(diǎn)。當(dāng)這兩個(gè)引物同時(shí)指導(dǎo)DNA合成時(shí)，突變的DNA鏈將不再含有該單一酶切位點(diǎn)，而模板DNA在該位置能被切割。通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，線(xiàn)性化的模板DNA不能復(fù)制，只有突變保持環(huán)狀，可以獲得轉(zhuǎn)化子。43、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變的方法、原理大引物PCR誘變；重疊延伸PCR誘變；重疊延伸剪接技術(shù)；同源重組法；雙向PCR快速定點(diǎn)誘變44、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變方法中，模板DNA的排除方法限制性?xún)?nèi)切酶 DpnI 可特異性切割dsDNA中的Gm6ATC位點(diǎn)，對(duì)半甲基化的DNA效率較低，完全不能切割非甲基化DNA。大腸桿菌體內(nèi)DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，對(duì)DpnI

45、敏感。用4種通用dNTP在體外合成的DNA沒(méi)有甲基化，可以抵抗DpnI的切割。第十章 DNA文庫(kù)的構(gòu)建和目的基因的篩選45、基因組DNA文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念基因組DNA文庫(kù)：將某生物體的全部基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。cDNA文庫(kù)（針對(duì)真核生物）：若這些陽(yáng)性菌落中所含的外源DNA不是基因組DNA，而是由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，則稱(chēng)之為cDNA文庫(kù)。cDNA不含內(nèi)含子。46、構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇。47、鳥(niǎo)槍法的概念（質(zhì)粒文庫(kù)）鳥(niǎo)槍法（霰彈法）：利用機(jī)械剪切力和超聲波等物理方法或限制性核酸內(nèi)切酶酶切等生化方法將生物chr.打斷，隨后通過(guò)T4 DNA連接酶把這些片段與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化受體菌后進(jìn)行無(wú)性繁殖，獲得一大群含不同外源D