分子生物學的基本竟能和策略1.ppt

1、周 俊 宜,分子生物學基本技能和策略,生化技術(shù) 電泳 層析 離心 分光光度 基因操作 其它,基因工程 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表,電泳 層析 離心 分光光度 基因操作 其它 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細胞） 篩（選陽性克?。?表（達目的基因）,基 本 模 式,“縱向”體系,“橫向”體系,1 理論部分,基因工程原理,生化技術(shù)原理,新技術(shù)講座,2 實驗部分,分子生物學實驗 生化技術(shù)實驗,3 示教和錄像部分,實驗原理 實驗技術(shù),基因工程原理,基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA 分子。,1972年,P.Berg: 構(gòu)建第一個DNA重組分

2、子,1997年,動物克隆: 克隆羊多莉,1977年，基因工程產(chǎn)品的出現(xiàn) H.W.Boyer,第一個基因工程產(chǎn)品(SS),1973年,S.S.Cohen:第一個基因克隆實驗,2001年，人類基因組計劃,Boyer 和Cohen的實驗,Boyer 和Cohen的實驗,培養(yǎng)平皿,大腸桿菌,抗四環(huán)素,抗卡那霉素,抗四環(huán)素抗卡那霉素,人體生長激素釋放激素(SS),抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用,目的基因,基因載體,重組體,分,切,接,轉(zhuǎn),篩,表,總體技術(shù)路線,目的基因及載體的分離,1 目的基因的獲取,需要克隆的DNA片段：,化學合成法,cDNA文庫 基因組DNA文庫,聚合酶鏈式反應(yīng),分,分,分,1）化學合成法

3、：,較短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物 測序引物 定點突變 核酸雜交探針,2）基因文庫,限制性內(nèi)切酶,克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定,基因組DNA,基因文庫,基因組DNA文庫,限制性內(nèi)切酶,基因組DNA,基因重組,轉(zhuǎn)化細菌,體外包裝,cDNA文庫的組建：,基因重組,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,引物,引物,3,5,5,5,3）PCR技術(shù),基因組,PCR技術(shù)的基本過程,模板DNA dNTP 引物 Buffer,預變性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,循環(huán)儀,94oC5,94 55 72 ,2 載體DNA的選擇,功能： 為目的基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力。 為目

4、的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。 為目的基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。,目的基因,整合在宿主細胞染色體DNA中,獨立于宿主細胞染色體DNA外,（獨立的復制子功能）,基因載體,理想載體的基本條件：,可轉(zhuǎn)移性 合適的復制位點 多克隆位點：廣泛、特異 選擇標志，便于篩選和鑒定 分子較小，可容納較大的外源DNA,質(zhì)粒 噬菌體 腺病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ,種類：,存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。 具有自我復制功能。 帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。 經(jīng)改造后具有多克隆位點。 舉例：pBR322質(zhì)粒,質(zhì)粒,宿主細胞,ori,抗Amp,宿主細菌,含Amp培養(yǎng)基,多克隆位點

5、,ori,復制起始點,遺傳標記,Amp,polylinker,基因載體, 噬菌體載體,50kb,+,LA,RA,LA,RA,EcoR ,EcoR ,lacZ,cI,限制性內(nèi)切酶酶切,切,酶切,限制性內(nèi)切核酸酶 在特異位點上切割DNA分子 分三類，常用為類酶 識別序列呈回文對稱 命名：酶來源的生物名稱縮寫 屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,EcoR的識別序列,Hae的識別序列,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG 3NNNNNCT

6、TAAp,EcoR的識別序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTT pAACNNNNN3 3NNNNNCAAp TTGNNNNN5,Hae的識別序列和酶切切口（平端）,磷酸二酯鍵的形成,DNA連接酶,DNA連接酶,DNA連接酶,目的基因與載體的連接,接,T4-DNA連接酶： T4-噬菌體 連接溫度：不高于粘性末端熔點溫度（Tm） 15： 15/6h； 12/8h； 8/12h；,連接方式： 相同粘性末端的連接 平頭末端的連接 不同粘性末端的連接 人工粘性末端的連接,粘端

7、連接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA連接酶,平端連接,AGCT,TCGA,Alu,DNA連接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,重組體的轉(zhuǎn)化,受體細胞,轉(zhuǎn),JM109感受態(tài),含氨芐平板,Am,重組質(zhì)粒,感受態(tài),原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）,1)受體細胞的選擇,限制缺陷型: 避免修飾和降解 重組缺陷型：避免重組整合 轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性 遺傳互補型：利于篩選 感染缺陷型：防止感染,2）轉(zhuǎn)化方法,CaCl2誘導轉(zhuǎn)化 電穿孔 PEG介導轉(zhuǎn)化 人工體外包裝,特殊處理,受體細胞,細胞膜特性改變,

8、CaCl2處理,受體細菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受態(tài)細菌,重組體轉(zhuǎn)入細菌,基因重組,轉(zhuǎn)染,體外包裝,噬菌體,噬菌體體外包裝,3）轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化細胞/細胞總數(shù) 影響因素： 載體：載體性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、分子大小等 受體細胞 轉(zhuǎn)化過程,重組體克隆的篩選與鑒定,篩,宿主細胞,轉(zhuǎn)化后的克隆群體：,1遺傳檢測法,1）抗藥性標志的選擇,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,2）標志補救（-半乳糖苷酶法）,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,2 電泳檢測法,凝膠電泳檢測,加樣孔,DNA Marker,空質(zhì)粒,重

9、組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒酶切,重組質(zhì)粒的PCR擴增片段,原位雜交,3 菌落雜交篩選法,4 免疫化學檢測法,放射性抗體檢測法,濾膜（固定抗體）,+,5 DNA序列檢測,外源基因在宿主細胞中的表達,重組子,目的基因的mRNA,表達蛋白質(zhì),大腸桿菌（ E.coli）受體細胞,表,1 E.coli表達體系 優(yōu)勢： 一種成熟的基因克隆表達的受體細胞 繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制 易于進行遺傳操作和高效表達,不足之處： 1）缺乏適當?shù)霓D(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機制。 2）缺乏表達蛋白質(zhì)復性系統(tǒng)，表達蛋白無特異性空間結(jié)構(gòu)。 3）表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。,2目的基因在E.coli中的高效表達,三個因素： 強化蛋白質(zhì)的生物合成 抑制蛋白質(zhì)的降解 恢復蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象,3目的基因表達產(chǎn)物的檢測,1）蛋白質(zhì)的PAGE,對照 樣品 Marker,2）表達蛋白生物學功能檢測,淀粉酶基因表達,4目的蛋白的分離純化,分子篩 親和柱 離子交換 抗原抗體,目的蛋白,基因載體,目的基因,質(zhì)粒 噬菌體 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文庫,限制性內(nèi)切酶,有切口的載體,有切口的目的基因,DNA連接酶,重組體,轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 體外