原位雜交探針設(shè)計(jì)原則

1、原位雜交探針大體可分為三類：寡核苷酸探針，cDNA探針，RNA探針。寡核苷酸探針由25bp左右的核苷酸組成，通?？梢杂晒竞铣桑捎谄湫蛄休^短，因此特異性較強(qiáng)，原位雜交時(shí)可以區(qū)分家族基因，同一基因的不同剪切體，cDNA探針長(zhǎng)約500bp左右，可以通過(guò)非對(duì)稱PCR擴(kuò)增合成，由于探針式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的結(jié)合不如RNA與RNA結(jié)合強(qiáng)，通常不采用，RNA探針長(zhǎng)約500bp左右，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，如果設(shè)計(jì)合理，其特異性是可以得到保證的，其主要缺點(diǎn)是容易被RNAse酶降解。查看原位雜交相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2000年以前的原位雜交常使用放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針，通過(guò)膠片曝光來(lái)顯色，2

2、000年以后的文獻(xiàn)常使用RNA探針。許多腎臟發(fā)育的文獻(xiàn)雖然有很多原位雜交數(shù)據(jù)，但卻沒有附帶上探針序列或者用于探針模板克隆的引物，通過(guò)了解廈門黃老師斑馬魚和昆明毛炳宇爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)方法，我們可以采用RNA探針。文獻(xiàn)中很難找到關(guān)于RNA探針設(shè)計(jì)的原則，有的文獻(xiàn)報(bào)道直接用cDNA合成RNA探針。借鑒爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)流程，以小鼠FGF10的探針設(shè)計(jì)為例進(jìn)行介紹。1. 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載該FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全長(zhǎng)在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇mouse genome+transcript，比對(duì)程序選擇somewhat similar seq

3、uence。 Zebrafish seqRNAs得出的比對(duì)結(jié)果中有一幅圖譜，顯示比對(duì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的相似性，探針應(yīng)設(shè)計(jì)在與其它基因不存在明顯相似性的區(qū)段，在比對(duì)結(jié)果的圖譜中選擇可變區(qū)。如下圖黑色框區(qū)域。2. 估計(jì)黑色框堿基在FGF10 mRNA中的大致范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)選擇長(zhǎng)約500bp的序列設(shè)計(jì)探針。根據(jù)上圖信息，我們選擇FGF3800的范圍進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。agcac agaggcacaa tgctttggtt tatgggtata ggttgcattt 3301 tgtggtgttc tttcaacttg ttttctgaca aatgggattt ttaaaatgta tacttctt

4、gt 3361 ggttggattc tgtatgttag agtttaattg gtaactgagt ctaaaggctc taatgtaatg 3421 aatctctaga agaactaggt atcttttttt acttttattt taaaataata attatacctg 3481 acacatgacc atggaccacc cacaaccaaa attaaatgtt tggggagaca aactatagta 3541 ttcagtgaca agggtaacag caaatagtgc agacgttgga ttcttatttc actttgccat 3601 ttagatta

5、ct aaagagacta tgtgtaaaca gtcatcatta tagtactcaa gacattaaac 3661 agcttctagc aaaatgtatc aaagcttgca gagtccaaaa atagaaaaca tctttccccc 3721 tctcccaccc tacatttccc cctgtatgca tcctaacaga gat底紋標(biāo)注的為引物序列3. 將設(shè)計(jì)好的探針序列在UCSC上再次比對(duì)分析，genome選擇mouse，query type選擇translated RNA，點(diǎn)擊submit，保證搜索出的條目只有目標(biāo)基因，如果存在其它非目標(biāo)匹配項(xiàng)（既不是來(lái)自FGF基因的序列），則需要重新選擇一段探針序列。你可以點(diǎn)擊browser瀏覽一下所設(shè)計(jì)的探針序列是否是FGF10的序列以及所在位置。在選擇探針序列時(shí)，盡量選擇3端的區(qū)域，避開可能的選擇性剪切，同時(shí)也要避免mRNA的末端序列，因?yàn)榭赡艽嬖诜g終