現(xiàn)代生物技術(shù)理論與實驗：藥物發(fā)現(xiàn)中的ADMET方法

1、III -藥物發(fā)現(xiàn)中的ADMET方法,什么是ADMET,Absorption 吸收 Distribution 分布 Metabolism 代謝 Excretion 排出 Toxicity 毒性 ADME是藥物動力學(xué)(Pharmacokinetics, PK)的內(nèi)容,成功藥物是個平衡體,藥物活性,藥物毒性,藥物必備性質(zhì),藥物必備性質(zhì) -藥物開發(fā)的前提條件,物理化學(xué)性質(zhì) 溶解性 化學(xué)穩(wěn)定性 生物學(xué)性質(zhì) 生物屏障滲透能力 藥物代謝性質(zhì)（生物穩(wěn)定性） 藥物排出性質(zhì) 蛋白質(zhì)和器官組織的結(jié)合力,藥物研發(fā)的并行策略,合成化合物 或 分離天然產(chǎn)物,生物活性 生物選擇性 物理化學(xué)性質(zhì) 藥物吸收 藥物代謝 大分子

2、結(jié)合 細(xì)胞毒性 ,優(yōu)化的 先導(dǎo)化合物,候選藥物,現(xiàn)代ADMET研究方法的特點,基于細(xì)胞或生物大分子的分析方法 人源材料的應(yīng)用 小樣品、高內(nèi)涵和高通量分析能力 能夠闡明藥物性質(zhì)的分子機(jī)理、建立結(jié)構(gòu)-藥物性質(zhì)定量構(gòu)效關(guān)系,合理藥物運輸/制劑系統(tǒng),以往的研究表明：藥物運輸系統(tǒng)只能輔助而不能根本性的改變藥物的口服吸收能力 合理的藥物運輸/制劑系統(tǒng)(rational drug delivery)必須依據(jù)藥物本身的穿越消化腸道屏障的滲透能力,BCS系統(tǒng),FDA制定了BCS的評價指南。BCS的評價主要包括下列三個方面： 藥物的生物滲透能力（permeability） 藥物的溶解能力（Solubility）

3、制劑的快速溶出能力（Immediate Release） 上述性質(zhì)符合要求的藥物/制劑可以在藥審時得到生物豁免。,藥物吸收,吸收屏障結(jié)構(gòu),底側(cè)（Basolateral）,頂側(cè)（Apical）,經(jīng)細(xì)胞連接 的被動擴(kuò)散 Paracellular diffusion,穿細(xì)胞 被動擴(kuò)散 Transcellular diffusion,代謝轉(zhuǎn)化 A B,外流Efflux,藥物轉(zhuǎn)運 transport,A,C,D,藥物消化道吸收的基本機(jī)制,體外單層腸上皮細(xì)胞藥物吸收模型,腸上皮細(xì)胞/細(xì)胞系,組織/細(xì)胞培養(yǎng),多空膜基底,吸收細(xì)胞單層,Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板,已被認(rèn)證的用于藥物吸收的細(xì)胞系,Caco-2

4、 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 具有分化的腸上皮細(xì)胞特征和重要的藥物轉(zhuǎn)運與代謝酶 MDCK 狗腎上皮細(xì)胞系,Caco-2藥物吸收模型的創(chuàng)建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究團(tuán)隊,Caco-2模型的制備過程,細(xì)胞培養(yǎng),Transwell接種,細(xì)胞匯合,細(xì)胞分化完備,細(xì)胞收集,2-3天,2-3天,23星期,藥物吸收 測試,試驗結(jié)果-滲透能力,吸收較好的藥物： Papp 210-6 Testosterone：1.010-5 cm/s Propranolol: 2.8610-5cm/s 吸收差藥物： Papp 10-6 Mannitol：1.010-7 cm/s Atenolol: Papp= 4

5、.5510-7 cm/s,Brain Blood Barrier（BBB）,BBB結(jié)構(gòu),內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 促進(jìn)細(xì)胞緊密連接 誘導(dǎo)一些酶和分子轉(zhuǎn)運蛋白 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長 毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞 趨化現(xiàn)象 表型的調(diào)節(jié),BBB滲透機(jī)理,influx,efflux,緊密連接（tight junction）的結(jié)構(gòu),AP端：血液,BL端：腦實質(zhì),毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,膠質(zhì)細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,基底膜,多孔聚碳酯膜,藥物排出,藥物清除 = 代謝 + 排出,腎排出：超濾機(jī)制,游離小分子藥物 及其代謝物,腎小球,腎小管,藥物重吸收,大分子化合物 大

6、分子結(jié)合藥物,腎排出因素：PPB 和 Papp,(Absorption fraction 0.9),(PPB0.05),膽汁分泌和腸肝循環(huán),Drug,Binding to cytoplasmic proteins,肝臟處置藥物的基本途徑,膽汁,NTCP,OATPs,OAT2,OATP2,MRPs,MDR1,BCRP,BSEP/SPGP,腸道,藥物,藥物,代謝物,Basal （blood）,Apical （bile）,OATP2,MDCKII,(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277(8), 6497-6593 (2002),藥物經(jīng)膽汁

7、排出的細(xì)胞模型- OATP2/MRP2 雙轉(zhuǎn)染 MDCK細(xì)胞單層,MRP2/cMOAT,藥物的肝臟代謝,藥物代謝的基本過程,藥物 R,氧化產(chǎn)物 R-OH,結(jié)合產(chǎn)物 R-O-X,排出物,I相代謝,II相代謝,II+相代謝：藥物外流,II相代謝,水解產(chǎn)物,X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione,I相代謝關(guān)鍵酶-細(xì)胞色素P450,細(xì)胞色素P450 (CYP)家族 CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 NADPH依賴的氧化酶 CYP3A4 是藥物的主要代謝酶

8、50%已知藥物通過CYP3A4代謝,II 相代謝關(guān)鍵酶,UDP-依賴葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT) 苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶 (PST) 雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶 (EST) 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 一些細(xì)胞抗氧化酶,三種肝細(xì)胞制品及代謝分析,全肝細(xì)胞代謝分析,肝微粒體代謝分析,S-9 肝勻漿液 代謝分析,藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析過程,藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析結(jié)果,% 原藥消失率 =,（1 - ）100%,原始藥物濃度c0,代謝反應(yīng)后藥物濃度ct,全肝細(xì)胞(),肝微粒體(),僅包括I相代謝酶 易于保存 分析操作容易、費用低,包括所有代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白 費用高，細(xì)胞保存不易,S9肝勻漿液(),包括主要I、II相代

9、謝酶 分析操作容易、費用低 勻漿液保存不穩(wěn)定,藥物毒性,藥物毒性評價的基本方式-細(xì)胞活力分析,細(xì)胞生長 細(xì)胞能荷 線粒體活性-MTT分析 細(xì)胞氧化還原狀態(tài)-谷胱甘肽含量分析 細(xì)胞特征性功能 蛋白質(zhì)合成 核酸合成 吞噬、排除外來分子能力等 細(xì)胞膜完整性-胞漿酶活性分析,MTT細(xì)胞活力分析,原理： 線粒體酶將探針分子MTT*還原成為一種藍(lán)色脂溶性染料formazan（吸收波長550nm） 線粒體活性越高，轉(zhuǎn)化能力越強(qiáng) 實驗方法：將MTT加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，反應(yīng)一段時間后，用有機(jī)溶劑溶解產(chǎn)生的formazan，然后用酶標(biāo)儀測定 550 nm吸光度. 特點：方法簡單可靠，費用低，高通量,* MTT：3

10、-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,藥物毒性分析過程,LD50，IC50，EC50,線粒體毒性模型,Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological Development World Pharmaceutical Congress, June, 2010,ROS,ATP synthesis,Cyt c,Djm,關(guān)于藥物毒性分析數(shù)據(jù),毒性分析的結(jié)果是LD50或IC50或EC50，表示藥物導(dǎo)致細(xì)胞活力降低一半時需要的濃度 LD50或IC50或EC5

11、0越小，藥物毒性越大 每種細(xì)胞活力分析方法都具有片面性，多種方法測定一種化合物毒性是有益的 進(jìn)行藥物毒性分析時，推薦使用人源的原代完整肝細(xì)胞，數(shù)據(jù)可靠性高 當(dāng)使用永生化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞時，由于這些細(xì)胞(特別是腫瘤細(xì)胞)的藥物代謝能力較差，因此得到的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)是一種“本征毒性(intrinsic toxicity)”。將實驗數(shù)據(jù)推廣應(yīng)用時，注意補(bǔ)償不同組織細(xì)胞的代謝能力。,藥物毒性和藥物-藥物相互作用,排出抑制型相互作用： 藥物1抑制藥物2的排出，導(dǎo)致藥物2濃度過高產(chǎn)生毒性 代謝抑制型相互作用 藥物1抑制藥物2的代謝，導(dǎo)致藥物2濃度過高產(chǎn)生毒性 代謝誘導(dǎo)型相互作用 藥物2誘導(dǎo)藥物2的代謝，導(dǎo)致

12、藥物2被過度活化，使代謝毒性產(chǎn)物濃度增加 藥物2因代謝失效,小結(jié)：ADMET研究諸方面,ADME：生物利用率,藥物間 相互作用,藥物分布,血漿蛋白 結(jié)合力,血腦屏障 滲透能力,藥物清除,藥物吸收,消化道穩(wěn)定性,腎排出,肝臟清除,代謝穩(wěn)定性,膽汁排出,溶解性,滲透能力,代謝誘導(dǎo),代謝抑制,藥物毒性T,細(xì)胞活力 抑制分析,排出抑制,擴(kuò)散能力,藥物外流載體,藥物吸收載體,代謝酶亞型,一個例子- 食物中的黃酮類化合物,食物成分黃酮類化合物及其作用,雌激素樣作用 弱類雌激素活性 防治一些和激素水平下降有關(guān)的疾病，如衰老、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、血脂升高等 抗雌激素活性 預(yù)防激素依賴型腫瘤及心血管疾病的發(fā)

13、生。 抗氧化作用 抑制腫瘤作用 降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防心血管疾病和老年性癡呆癥,黃酮通式,異黃酮通式,黃酮苷和黃酮苷元,大豆異黃酮苷元,大豆異黃酮葡萄糖甙,水解,b-葡萄糖苷酶（腸道微生物）,腸道乳糖-根皮素水解酶,O,黃酮類化合物的吸收代謝機(jī)制,黃酮苷,黃酮苷元,水解,CYPs 代謝分解,MRP2,BCRP,UGT,SulT,緊密連接,MRP3,酶水解,酶水解,肝、腎排出,黃酮類化合物吸收的關(guān)鍵因素,黃酮苷的水解-利于吸收因素 腸道正常細(xì)菌群 黃酮苷元的代謝穩(wěn)定性-不利于吸收因素 II相代謝和II+向外排出 I相氧化分解 解決方法： 混合黃酮制劑 苷元羥基甲基化,思考題,什么是ADMET研究，在藥物發(fā)現(xiàn)中的作用是什么？ 現(xiàn)代ADMET方法有什么特點？ 什么是BCS？ 藥物消化道吸收的分子機(jī)制有那些？ 什么是Caco-2模型？如何從Pa