基因工程：第六章 大腸桿菌基因工程.ppt

1、生物工程專業(yè)核心課程,基 因 工 程,華東理工大學 張惠展,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本條件,基因工程的操作過程,目的基因的克隆與基因文庫的構建,大腸桿菌基因工程,酵母基因工程,哺乳動物基因工程,高等植物基因工程,D 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策,6 大腸桿菌基因工程,C 大腸桿菌基因工程菌的構建策略,B 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理,A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,E 利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,6 大腸桿菌基因工程,大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢,全基因組

2、測序，共有4405個開放型閱讀框架,基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善,繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定,被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物,A 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,6 大腸桿菌基因工程,大腸桿菌表達外源基因的劣勢,缺乏對真核生物蛋白質的復性功能,缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng),內(nèi)源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白,細胞周質內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素,B 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理,6 大腸桿菌基因工程,啟動子,終止子,核糖體結合位點,密碼子,質?？截悢?shù),啟動子,啟動子最佳距離的探測,目的基因,E,E,A,啟動子,A 酶切開,Bal31酶解,目的基因,啟動子,啟

3、動子的篩選,Apr,ori,galK,pKO1,終止密碼子,采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段,克隆到啟動子探針質粒pKO1上,受體細胞染色體DNA上的galE、galT與質,粒上報告基因galk的表達產(chǎn)物聯(lián)合作用，,可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質,轉化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株,含有外源啟動子活性的重組克隆,啟動子,啟動子的構建,-35 區(qū)序列,-10 區(qū)序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,啟動子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T

4、A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,啟動子,啟動子的可控性,P,乳糖啟動子Plac的可控性：,O,P,O,高效轉錄,阻遏蛋白,誘導,乳糖 異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac與其控制區(qū)Olac,偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物,存在時，整個操縱子處于基,基底水平轉錄,底水平表達；誘導物可以使,啟動子Plac介導的轉錄大幅,提高,啟動子,啟動子的可控性,Plac,乳糖啟動子Plac的可控性：,O,Plac,O,高

5、效轉錄,葡萄糖代謝,野生型的Plac上游附近擁有,代謝激活因子（CAP）結合,區(qū)，cAMP激活CAP，CAP,基底水平轉錄,結合啟動子控制區(qū)，進而促,進Plac介導的轉錄。葡萄糖,代謝使cAMP減少，也能阻,遏Plac介導的轉錄。因此，,基因工程中使用的乳糖啟動,子均為抗葡萄糖代謝阻遏的,突變型，即Plac UV5,CAP,cAMP,cAMP濃度降低,Plac UV5,O,高效轉錄,啟動子,啟動子的可控性,Ptrp,色氨酸啟動子Ptrp的可控性：,Otrp,除去色氨酸,色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白復合物的阻遏，轉錄呈基底,狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸,基底水平轉錄,或者加入3-吲哚

6、丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去,色氨酸是困難的，因此基因工程,中往往添加IAA誘導Ptrp介導的目,基因的表達,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效轉錄,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效轉錄,Otrp,Ptrp,啟動子,啟動子的可控性,l噬菌體啟動子PlL的可控性：,噬菌體啟動子PL受CI阻遏蛋白阻,遏，很難直接誘導控制。在基因,工程中常使用溫度敏感型的cI突,變基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋,在42時失活脫落，PL便可介導,目的基因的表達。但在大型細菌,培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因,此常使用一個雙質粒控制系統(tǒng)，,用色氨酸間

7、接控制目的基因表達,Ptrp,A,B,cI857,PL,目的基因,阻遏作用,Ptrp,A,B,PL,表達,色氨酸,終止子,強化轉錄終止的必要性,外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物 過長轉錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下： 轉錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的復制及其它生物功能，

8、甚至導致重組質粒的不穩(wěn)定性； 過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率,終止子,強終止子的選擇與使用,目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結構，以增強其轉錄終止作用 終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質粒從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選,pCP1,Apr,ori,Tcr,篩選Apr、Tcs的轉化子,核糖體結合位點,外源基因在大腸

9、桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）,核糖體結合位點,大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素： 位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域3 AUUCCUCC 5并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始

10、密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子； SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成； 基因編碼區(qū)5 端若干密碼子的堿基序列,核糖體結合位點的結構,核糖體結合位點,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列的影響：,一般來說，mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD序列與16S rRNA的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低,核糖體結合位點,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列與起始密

11、碼子之間的序列的影響：,SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水平低20倍,核糖體結合位點,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：,SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AU

12、G之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低,核糖體結合位點,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響：,大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最

13、佳的,密碼子,生物體對密碼子的偏愛性,不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼,子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：,生物基因組中的堿基含量 在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體,fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC,豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子,占90%以上的絕對優(yōu)勢,密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強度規(guī)律,細胞內(nèi)tRNA的含量,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；,如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,密碼子

14、,密碼子偏愛性對外源基因表達的影響,由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程,大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高,效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略,可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：,外源基因全合成,同步表達相關tRNA編碼基因,密碼子,密碼子偏愛性對外源基因表達的影響,按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設計更換外源基因中不適宜的相應簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法,外源基因全合成,密碼子,密碼子偏愛性對外源基因表達的影響,對于那些含有不和諧密碼子種類單一、

15、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關tRNA編碼基因同步克隆表達的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個密碼子中，共含有22個精氨酸密碼子，其中7個AGG、2個AGA，而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達，將大腸桿菌的這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高表達的質粒上。由此構建的大腸桿菌雙質粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用,同步表達相關tRNA編碼基因,質?？截悢?shù),質?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響,目前實驗室里廣泛使用的表達型質粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷

16、貝，質粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質粒的擴增納入可控制的軌道,質?？截悢?shù),質粒擴增時序的控制,pCP3擁有一個溫度可誘導型的復制子,pCP3,PL,MCS,ori,Apr,在28時，每個細胞的質?？截悢?shù)為60,在42時，拷貝數(shù)迅速增至300 - 600,在此溫度下，受體細胞染色體上的CI基,因表達的溫度敏感型阻遏蛋白失活,因此，用一種手段同時控制質?？?貝數(shù)和基因的表達,C 大

17、腸桿菌基因工程菌的構建策略,6 大腸桿菌基因工程,包涵體型異源蛋白的表達,分泌型異源蛋白的表達,融合型異源蛋白的表達,寡聚型異源蛋白的表達,整合型異源蛋白的表達,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體及其性質,在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白質的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質粒構建的大腸桿菌工

18、程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子,包涵體型異源蛋白的表達,以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作,包涵體表達形式的優(yōu)點：,包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來,能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定,在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構不成威脅,包涵體型異源蛋白的表達,以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,包涵體表達形式的

19、缺點：,以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關重要。然而，這也是一個技術難題，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白質的成功率相當?shù)?，一般不超過30%,包涵體型異源蛋白的表達,以包涵體形式表達目的蛋白的操作,如果未進行特殊設計（如分泌型表達或融合型表達），外源基因在大腸桿菌中表達的蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時，表達產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達目的基因操作的關鍵就是選擇高表達的載體。事實上，這種高表達率也是包涵體

20、法的長處所在,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體的變性與復性操作,C 共價修飾的蛋白質,蛋白質變性復性的動力學原理：,C1,C2,Cn,C,U,I 1,I n,N,X1,X2,Xn,X,Ag,Ag,Ag,Ag,I 有效變復性過程中的中間狀態(tài),X 脫離有效變復性過程而進入集聚的中間狀態(tài),N 天然狀態(tài)的蛋白質,U 變性狀態(tài)的蛋白質,A 集聚狀態(tài)的蛋白質,在細菌細胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質不能進入復性過程，因此永遠成為,無活性的蛋白質。包涵體中的蛋白質就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人,工變性（解除共價修飾和驅散集聚體）復性操作,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體的變性與復性操作,包涵體的溶解與變

21、性：,包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵,在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。能有效促進,包涵體溶解變性的試劑和條件包括：,清洗劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化,促溶劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā),形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應,混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強,極端pH 廉價，但許多蛋白質在極端pH條件下發(fā)生修飾反應,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體的變性與復性操作,包涵體的復性與重折疊（refolding）：,包涵體的復性與重折疊的主要任務是：,通過次級鍵的形成使蛋白質復性,將多肽鏈中被拆

22、開的游離巰基重新折疊,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體的變性與復性操作,包涵體的復性與重折疊（refolding）：復性操作,包涵體復性操作的方法包括：,分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生,一步稀釋法，蛋白復性與濃度無關，但集聚與濃度關系很大,試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+,蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；鞍讕ж撾?，抑制集聚,產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞,分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體的變性與復性操作,包涵體的復性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成,在包涵體變性

23、體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防,化學氧化法（A）需要電子受體，最廉價的電子受體為空氣，二硫鍵形成是,二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵,止二硫鍵錯配導致嚴重的集聚。在變性操作結束后，這些游離型的巰基必須重新,配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式主要有：,隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質的重折疊,形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好,+,2e,+,2H+,A,S-S-R,HS,+,B,R-S-S-R,2R-SH,分泌型異源蛋白的表達,在大腸桿菌中表達的異源蛋白按其在細胞中的定位可分為兩種形

24、式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細胞質中；或者通過運輸或分泌方式定位于細胞周質，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號肽序列的存在是蛋白質分泌的前提條件,分泌型異源蛋白的表達,以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,分泌表達形式的優(yōu)點：,目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn),穩(wěn)定性大約是在細胞質中的10倍,目的蛋白易于分離,目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有,甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表達時，蛋白質,N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸,桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其N端,的甲硫氨酸殘基便可在信號肽

25、的剪切過程中被有效除去,分泌型異源蛋白的表達,以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,分泌表達形式的缺點：,相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達，少數(shù)外源基因既便能分泌表達，但其表達率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍,分泌型異源蛋白的表達,蛋白質的分泌機制,原核細菌周質中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機折疊，分泌在細胞周質或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感,分泌型異源蛋白

26、的表達,分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建,包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質直接分,泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌,到培養(yǎng)基中，這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi),上的磷酸酯酶，導致細菌內(nèi)外膜的通透性增大。,因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質粒上,即可構建完全分泌型的受體細胞。此時，用另一種攜帶大腸桿菌信號,肽編碼序列和目的基因的表達質粒轉化上述完全分泌型受體細胞，并,使用相同性質的啟動子介導目的基因的轉錄，則可實現(xiàn)目的蛋白從重,組大腸桿菌中的完全分泌。,融合型異源蛋白的表達,除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體

27、菌自身的蛋白質編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結構中，通常受體細菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白,融合型異源蛋白的表達,以融合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳,目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進,目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件,胞內(nèi)形成良好的空間構象，且大多具有水溶性,目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往

28、就在該工段,行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白,目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在,目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲,融合型異源蛋白的表達,融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建,融合蛋白表達質粒的構建原則：,受體細胞的結構基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和,層析進行特異性簡單純化,兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定著,為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件,外源基因應裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終,止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結構基因，目,的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，,融合蛋白的裂解工藝

29、,兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架,融合型異源蛋白的表達,融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建,用于融合蛋白構建的受體蛋白：,谷胱甘肽轉移酶（GST） 維持良好空間構象,硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構象 pTrxFus,麥芽糖結合蛋白（MBP） 促進分泌,金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫親和層析 pRIT2T,外膜蛋白（OmpF） 促進分泌,b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫親和層析,泛素蛋白（Ubi） 維持良好空間構象,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構象和生物活性，如果將之注入人體還會導致免疫反應，因此在制備和生產(chǎn)藥

30、用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種： 化學斷裂法 酶促裂解法,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側鏈的硫醚基反應，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點是回收率高（可達到85%以上），專一性強，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸

31、殘基，則不能用此方法,化學斷裂法：,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,酶促裂解法：單殘基位點,蛋白內(nèi)切酶,切割位點,梭菌蛋白酶 Arg-C,葡萄球菌蛋白酶 Glu-C,假單孢菌蛋白酶 Lys-C,豬胰蛋白酶 Arg-C,Lys-C,蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高，,同時每種蛋白酶均具有相應的斷裂位點決定,簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較,廣。幾種斷裂位點專一性最強的商品化蛋白,酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨,酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的,下游斷裂肽段，與溴化氰化學斷裂法相似。,用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外,源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或,賴氨

32、酸殘基，如果外源基因表達產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但,大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當高的,Arg C,N,N,C,受體蛋白,目的蛋白,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,酶促裂解法：多殘基位點,為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成

33、，大多數(shù)蛋白質中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,酶促裂解法：多殘基位點,啟動子,受體基因,接頭,目的基因,Met,Arg,Stop,Lys,Glu,Ile-Glu-gly-Arg,Arg,Lys,Glu,Ile-Glu-gly-Arg,表達,親和層析,酶解回收,融合型異源蛋白的表達,目的蛋白的回收,酶促裂解法：多殘基位點,Pinpoint Xa,tac,生物素結合肽編碼序列,Xa因子識別位點編碼序列,SP6,T7,Apr,ori,MCS,ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA G

34、CT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC,Xa-1,Ile Glu Gly Arg Glu,ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C,Xa-2,ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC,Xa-3,NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV B

35、glII SmaI NotI,Xa因子切割位點,寡聚型異源蛋白的表達,從理論上講，外源基因的表達水平與受體細胞中可轉錄基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關。然而重組質粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉錄基因，如作為篩選標記的抗生素抗性基因等。隨著重組質?？截悢?shù)的不斷增加，受體細胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質粒編碼蛋白，而細胞的正常生長代謝卻因能量不濟受到影響，因此通過增加質粒拷貝數(shù)提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。 另一種通過增加外源基因劑量而提高目標蛋白產(chǎn)量的有效方法是構建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個低拷貝質粒上，以取代單拷貝外源

36、基因在高拷貝載體上表達的策略,寡聚型異源蛋白的表達,以寡聚形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,目的蛋白高效表達,在不提高質?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以,穩(wěn)定表達小分子短肽,在一定程度上改善表達量,目的產(chǎn)物回收困難,短肽由于缺乏有效的空間結構，在細菌細胞中的半衰期較短。,串聯(lián)短肽具有與蛋白質相似的長度及空間結構，因而抗蛋白酶,降解的能力大幅度提高,寡聚短肽需要裂解和進一步分離，才能獲最終分子，但裂解后,的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性,寡聚型異源蛋白的表達,寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建,P,SD,gene,gene,gene,gene,T1 T2,H2N,COOH,Met,Met,Met,M

37、et,mRNA,CNBr,基本戰(zhàn)略：,寡聚型異源蛋白的表達,寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構建,構建舉例：,EcoRI,BamHI,Bgl II,EcoRI,BamHI,Bgl II,EcoRI + BamHI,Bgl II + BamHI,BamHI,整合型異源蛋白的表達,以整合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,目的基因穩(wěn)定表達,整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA的復制而復制，在大,多數(shù)情況下相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù),目的基因表達率低,單拷貝整合的目的基因表達率受到限制，此時可通過強化表達,元件而加以補償,培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目,的的基因工程案例特別

38、有意義,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機制，其可能的生物學功效是促進生物種群的進化。細胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：,轉位因子依賴型,同源序列依賴型,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉位因子是指生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復制能力的DNA可移動因子，不同生物種群擁有結構不同的轉位因子，例如：,轉位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉位因子家族,噬菌體 G片段（G-Fragment）,原核細菌 插入順序（IS）,真核細菌 轉座子（Tn、Ty）,高等植物 可移動因子（Ac、Ds）,高等動物 跳躍基因（mobil gene

39、）,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉位因子的結構,IS（1 kb）,Ty（5 kb）,Tn（2 - 20 kb）,ACCATGGTT,TTGGTACCA,抗藥性基因,轉位酶基因,識別位點,阻遏基因,IR,IR,IR,IR,IS,IS,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉位因子依賴型的體內(nèi)重組：整合形式,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,在很多原核細菌細胞中，染色體DNA鏈上的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細菌種類、兩個同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長度、同源程度密切相關。一般地說，距離越遠、長度越長、同源性越高，重

40、組的頻率也就越高，反之亦然。 同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個斷裂位點，而后者涉及兩個斷裂位點,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合,ori,目的基因,同源區(qū)域,標記基因,整合位點,染色體DNA,整合型異源蛋白的表達,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換,ori,目的基因,同源區(qū)域,標記基因,交換區(qū)域,染色體DNA,ori,標記基因,+,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,無論是在真核生物還是在原核細胞中，重組目的蛋白表達后都會面臨被降解的命運，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體

41、細胞內(nèi)源性蛋白質。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結為對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來越多的實驗表明，重組目的蛋白在受體細胞內(nèi)的半衰期可以通過蛋白序列的人工設計以及受體細胞的改造加以調整和控制。,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,實驗結果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于ATP。lon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白的過量表達也可作為一種環(huán)境壓力誘導lon基因的表達。lon-的大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短的細菌調控蛋白（如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增

42、，因此被廣泛用作外源基因高效表達的受體菌。,蛋白酶缺陷型受體細胞的改造,lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon -）：,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對異常或異源蛋白的降解也有重要作用，其機理是脅迫異常或異源蛋白形成一種對蛋白酶識別和降解較有利的空間構象，從而提高異常或異源蛋白對蛋白酶的敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR的突變株均呈現(xiàn)出對異源蛋白降解作用的嚴重缺陷，特別是lon-htpR-的雙缺陷株，非常適合高效表達各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白。,蛋白酶缺陷型受體細胞的改造,htpR基因缺陷的大腸桿菌受

43、體（htpR -）：,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,大量的實驗結果表明，在所有的極性氨基酸中，天門冬氨酸（Asp）的存在對提高蛋白質穩(wěn)定性的效應最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質的穩(wěn)定性就越大。更為重要的是，在多種結構和功能相互獨立的蛋白質C末端引入Asp殘基，都能顯著地延長這些蛋白質的半衰期，因此具有普遍意義。,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設計,多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：,蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建,大量的實驗結果同時表明，如果多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，則蛋白質的穩(wěn)定性顯著改善。 相反，N末端含有Pro、Glu、S

44、er、Thr的真核生物蛋白質，在真核和原核細胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)。,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設計,多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：,D 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策,6 大腸桿菌基因工程,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式,基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質粒的不穩(wěn)定性，,這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：,結構不穩(wěn)定性,重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致,其表觀生物學功能的喪失,分配

45、不穩(wěn)定性,整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制,受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解,能量、物質的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導受體細胞,外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝,產(chǎn)生應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序,重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配,這是重組質粒逃逸的基本原因,受體細胞中內(nèi)源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,重組質粒的逃逸率,一部分細胞不再攜帶重組質粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為,當含有重組質粒的工程菌在非選擇性條件下生長

46、時，培養(yǎng)系統(tǒng)中,稱為重組質粒的宏觀逃逸率。重組質粒逃逸的原因有：,高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（,吖啶）促使重組質粒滲漏,受體細胞中的核酸酶降解重組質粒,重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質粒,拷貝數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,改進載體受體系統(tǒng),以增大質粒穩(wěn)定性為目的的構建方法包括：,將R1質粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產(chǎn)物可以,選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質粒細胞,正確設置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi),將受體細胞的致死性基因安裝在載體上，同時構建條件致死,性的相應受體系統(tǒng)，如大

47、腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結合,蛋白編碼基因,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,施加選擇壓力,根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的抗生素,藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素,根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應的營,培養(yǎng)基復雜，成本較高,養(yǎng)組份,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,控制目的基因的過量表達,使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度,使用可控型復制子控制質粒的定時增殖或降低質粒的拷貝數(shù),優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定,培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質粒的穩(wěn)定,E 利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,6 大腸桿菌基因工程,

48、胰島素的結構及其生物合成,人胰島素的生產(chǎn)方法,重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建,胰島素的結構及其生物合成,S,S,S,S,C,N,S,S,B 肽（30）,C 肽（31）,A 肽（21）,R,R,R,K,S,S,S,S,C,N,S,S,N,C,高爾基體內(nèi)的特異性肽酶,N,C,信號肽,B 肽,C 肽,A 肽,信號肽酶,人胰島素的生產(chǎn)方法,直接提取法制人胰島素,迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：,早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料,供應的限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨,床需求。,人胰島素的生產(chǎn)方法,化學合成法制人胰島素,根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。這,條化學全合成的路線從技術上來說是能夠做到的，但其生產(chǎn),成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應用。,人胰島素的生產(chǎn)方法,化學轉型法制人胰島素,豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素,與人胰島素只在B鏈的C末端有一個氨基酸的差異，豬的為Ala，人,的為Thr，因此將豬胰島素在體外酶促轉化為人胰島素不失為一種,選擇。,上述思路的技術路線是：在pH為6-7的有機相中使胰蛋白酶催,化其逆反應，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B,鏈C末端的丙氨酸交換下來，所形成的