核酸、多糖和脂類的組織化學(xué)演示課件

1、1,組織化學(xué)技術(shù)概論,2,組織化學(xué)是在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上，通過化學(xué)或物理反應(yīng)原理，研究細(xì)胞或組織中物質(zhì)的化學(xué)組成、定位、定量以及代謝狀態(tài)的學(xué)科。是組織學(xué)與生物化學(xué)的邊緣學(xué)科。其目的是聯(lián)系形態(tài)、化學(xué)成分和功能來了解細(xì)胞或組織的代謝變化。組織化學(xué)反應(yīng)如與電鏡技術(shù)結(jié)合，簡稱電鏡組化。通過離心技術(shù)對分離的細(xì)胞進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)及細(xì)胞光度計的測量，則屬于細(xì)胞化學(xué)的范疇。分布于組織中的物質(zhì)能作為抗原時，則可在組織切片上觀察該物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)，為此所采用的技術(shù)方法稱為免役組織化學(xué)方法,3,一般組織化學(xué)方法 應(yīng)用一些化學(xué)試劑與組織或細(xì)胞內(nèi)的生物大分子或有機(jī)小分子等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成有顏色的反應(yīng)物沉淀，以原位顯

2、示相應(yīng)成分在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布或含量,4,方法種類： 化學(xué)方法 如各種酶類酶、PAS反應(yīng)等 類化學(xué)方法 物理學(xué)方法如蘇丹染料溶于脂類 物理化學(xué)方法 生物學(xué)特性方法 如免役組織化學(xué)方法,5,基本要求： 在操作中必須保持組織或細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整狀態(tài)免受破壞，以確保反應(yīng)產(chǎn)物的定位準(zhǔn)確。 反應(yīng)產(chǎn)物必須為有色沉淀，定位于原位，不被溶解，且反應(yīng)物沉淀顏色深度與相應(yīng)物質(zhì)含量 有一定的量效關(guān)系。 反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性。 反應(yīng)具有一定的特異性，排除假陽性干擾。 反應(yīng)具有一定的靈敏性，必須能將含量極微的物質(zhì)顯示出來。 要有重復(fù)性。方法穩(wěn)定可靠，能被重復(fù)而結(jié)果不變,6,基本程序 組織的固定 組織切片的制備 染

3、色漂洗 封固,7,固定液的選擇 核酸 蛋白質(zhì) 多糖 脂類 切片的制備 常規(guī)石蠟包埋能改變組織內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)，甚至將細(xì)胞內(nèi)的一些可溶性物質(zhì)完全丟失，故經(jīng)常采用冰凍切片的方法。最常用的是恒冷箱切片機(jī)。 新鮮組織的制備：新鮮組織取出后應(yīng)盡快放入驟冷劑內(nèi)驟冷以防產(chǎn)生冰晶。常用的有,8,注意 1. 力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。 2. 組織塊不易過大過厚。 3. 固定液必須有足夠的量。 4. 組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象,9,核酸、多糖和脂類的組織化學(xué),10,顯示DNA和RNA的方法 (Feulgen反應(yīng),11,原理 弱酸（1N Hcl）水解細(xì)胞核中DNA，打開嘌呤堿基和脫

4、氧核糖連接的雙鍵，釋放出醛基，然后與Schiff試劑結(jié)合。Schiff試劑的主要成分是堿性品紅。堿性品紅和偏重亞硫酸鈉相作用，形成無色的品紅-硫酸復(fù)合物。堿性品紅為醌狀結(jié)構(gòu)，硫酸破壞醌狀結(jié)構(gòu)而為無色的Schiff試劑。與標(biāo)本接觸后，無色品紅即與核酸水解后釋放出的醛基結(jié)合成具有醌狀結(jié)構(gòu)的紅紫色化合物，從而使DNA著色,12,試劑配制 1. Schiff試劑 1N Hcl 20ml；堿性品紅 1g；重亞硫酸鈉 1g；活性炭；蒸餾水 200ml。 2.偏重亞硫酸水 10%偏重亞硫酸鈉 5ml；1N Hcl 5ml；蒸餾水 90ml。臨用時配,13,步驟 1在預(yù)熱至60的1N Hcl中水解8-10分鐘

5、。1N Hcl在臨用前預(yù)熱半小時。 2冷1N Hcl稍洗。 3入Schiff試劑40-60分鐘。 4亞硫酸水洗三次，時間視顏色深淺而定。 5流水沖洗5分鐘。 6蒸餾水洗。 7甘油明膠封固,14,結(jié)果： 細(xì)胞核染成紅紫色,15,對照： 在入預(yù)熱的鹽酸之前，用DNA酶消化DNA，其他步驟相同。對照的切片DNA不著色,16,說明： 在加入活性炭之前，試劑顏色為草黃色為好。試劑應(yīng)配在棕色瓶中，并用黑色紙或塑料袋包好，密封避光保存，置于冰箱內(nèi)，這樣在4。C可保存半年左右。所用的瓶子要盡量小，防止SO2逸出。 Hcl的水解時間和固定液種類有關(guān),17,糖原的染色 （高碘酸-雪夫，PAS反應(yīng),18,原理 通過

6、高碘酸的強(qiáng)氧化作用，打開糖殘基中二醇基（CHOH-CHOH）的碳-碳鍵，形成二醛基（CHO-CHO）。這些二醛基與雪夫試劑中無色的亞硫酸品紅反應(yīng)生成紫紅色的不溶性復(fù)合物（醛染料產(chǎn)物），從而證明多糖或粘多糖的存在,19,20,試劑配制 1. 0.1%過碘酸溶液 2. 亞硫酸水 3. Schiff試劑,21,操作步驟 1. 切片入0.1%過碘酸溶液15分鐘。 2. 蒸餾水洗。 3. 入Schiff試劑15-60分鐘。 4. 亞硫酸水洗三次。 5. 流水沖洗5-10分鐘，蒸餾水 6. 甘油明膠封固,22,結(jié)果： 糖原呈紫紅色顆粒,23,碳水化合物組織化學(xué)染色（periodic acid Schiff

7、 reaction, PAS reaction,25,對照 用淀粉酶消化對照。切片用0.5%淀粉糖化酶37。C消化30-40分鐘或室溫1小時，流水沖洗，蒸餾水洗，其他步驟相同。經(jīng)消化后的對照片糖原所在部位不呈紫紅色（PAS陰性,26,說明 1. 過碘酸溶液濃度不能超過2.5%，pH不超過5，室溫下氧化時間不可過長。 2. 若Schiff試劑已變成粉紅色，則說明它已變質(zhì)失效而不能使用。 3. 組織切片可因多種原因而有自由醛基存在，可用相鄰切片做陽性對照，即切片不用高碘酸氧化而直接進(jìn)入雪夫試劑，若出現(xiàn)紅色，即為假陽性。必要時可在高碘酸氧化前用硼氫化鈉封閉自由醛基,27,脂類的染色 蘇丹黑-B顯示脂

8、類法,28,原理: 蘇丹黑-B溶解于脂滴中，使其染為 黑色,29,試劑配制 : 蘇丹黑染液 70%乙醇 100ml；蘇丹黑-B 1g。充分混合。可加熱煮沸2-3分鐘，或把染料溶解放置2日后使之變成充分的飽和液。用前過濾，此液不可久存,30,操作步驟: 1. 冰凍切片入50%酒精2分鐘，再入70%酒精2分鐘。 2.切片入染色液20-60分鐘（如置溫箱可適當(dāng)縮短時間）。 3. 流水沖洗，蒸餾水洗。 4. 甘油明膠封片,31,結(jié)果: 脂類及磷脂呈黑色,32,脂肪組織（adipose tissue,33,對照 切片入氯仿-甲醇（2：1）溶液，室溫下1小時，用梯度酒精脫氯仿-甲醇（由無水乙醇下行至70%乙醇，各2分鐘），蘇丹黑-B染液染色5-10分鐘，以后步驟同。脂