實(shí)驗(yàn)5血液葡萄糖的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)五 血液葡萄糖的測(cè)定,TELE-mail：manna_,光度測(cè)定法的原理及應(yīng)用,光度法是利用某一物質(zhì)的溶液吸收某一波段光的程度來(lái)測(cè)知該物質(zhì)在溶液中的濃度,光度法的原理,1.蘭伯特比爾定律 蘭伯特(Lambert) 闡明了透過(guò)光線的強(qiáng)度(I)和吸收層厚度(L)的關(guān)系,I=I010-KL,I=I010-KC,比爾(Beer)又提出了透過(guò)光線的強(qiáng)度(I)和吸收物濃度(C)之間也具有類似的關(guān)系,二者的結(jié)合稱為蘭伯特比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： I=I010-KCL log（I0/I)= KCL,L,蘭伯特比爾定律數(shù)學(xué)表達(dá)式,ODlg（I0/I)= KCL 式中OD：光密度；

2、描述溶液對(duì)光的吸收程度； L：液層厚度(光程長(zhǎng)度)，通常以cm為單位； c：溶液的濃度，單位gL K: 吸光系數(shù)，單位Lgcm ； 或: OD lg（I0/I)= CL L：液層厚度(光程長(zhǎng)度)，為1cm； c：溶液的摩爾濃度，單位molL； ：摩爾吸光系數(shù)，單位Lmolcm K與的關(guān)系為： K =/M （M為摩爾質(zhì)量,2.摩爾吸光系數(shù)的討論,1）在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度。 （2）吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)；不隨濃度c和光程長(zhǎng)度L的改變而改變。在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)； （3）可作為

3、定性鑒定的參數(shù),光度法的計(jì)算,OD標(biāo)KC標(biāo)L OD測(cè) KC測(cè)L,OD標(biāo)KC標(biāo)L OD測(cè) KC測(cè)L,1) 計(jì)算法（標(biāo)準(zhǔn)品法測(cè)定未知樣品含量,2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法,分光光度計(jì)的構(gòu)造,1）預(yù)熱儀器：為使測(cè)定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時(shí)和在不測(cè)定時(shí)應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。 2）選定波長(zhǎng)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長(zhǎng)。 3)加樣：比色杯中加入空白及待測(cè)樣品，并放入分光光度計(jì)中，注意：加入樣品量不超過(guò)比色杯體積的2/3。且比色杯放入儀器前，要將外壁擦干凈。 空白對(duì)照管1，標(biāo)準(zhǔn)管2，測(cè)定管3,分光光度計(jì)的使用,4

4、）調(diào)模式為“透射比”：對(duì)空白對(duì)照進(jìn)行調(diào)“0”（開蓋）和調(diào)“100”（閉蓋）。 5）調(diào)模式為“吸光度”：將儀表上“透光率T”調(diào)至“吸光率A”，輕輕拉動(dòng)比色皿座架拉桿，使有色溶液進(jìn)入光路，此時(shí)表頭指針?biāo)緸樵撚猩芤旱奈舛萇D。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。 6）關(guān)機(jī)：實(shí)驗(yàn)完畢，將比色皿取出洗凈，放在濾紙上涼干。關(guān)閉儀器,注意事項(xiàng)1）為了防止光電管疲勞。不測(cè)定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長(zhǎng)光電管使用壽命。2）比色皿的使用方法：拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。測(cè)定有色溶液吸光度時(shí)，一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在

5、測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常都按由稀到濃的順序測(cè)定，以減小測(cè)量誤差,比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護(hù)透光面。 每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿。清洗比色皿時(shí)，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。 不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面,實(shí)驗(yàn)原理,血糖：指血液中的單糖（葡萄糖） 葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖中的醛基被氧化成羧基，而銅試劑中的二價(jià)銅，被還原成磚紅色氧化亞銅而沉淀。 氧化亞銅可使磷鉬酸還原生成鉬藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色。其生成藍(lán)色的深度與血濾液中葡萄糖濃度成正比。選用顏色深淺

6、較接近于測(cè)定管的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測(cè)定管中葡萄糖的含量。 福林-吳憲氏法測(cè)定血糖是在特制福林-吳憲血糖管（用前不需刷洗，要保持內(nèi)壁干燥）中進(jìn)行。該血糖管于4mL容量處，管頸縮小成一細(xì)管狀，這樣可以減少在煮沸時(shí)管內(nèi)液體與空氣的接觸，以避免產(chǎn)生的氧化亞銅再氧化,葡萄糖Cu2,葡萄糖酸Cu2O,磷鉬酸,鉬藍(lán),Cu2,全血無(wú)蛋白濾液 葡萄糖 堿性銅試劑 Cu(OH) 2 磷鉬酸試劑 磷鉬酸,操作步驟,1）用鎢酸法制備1：10全血無(wú)蛋白濾液 水 1.4 ml 全血 0.2 ml 2/3N硫酸 0.2 ml（隨加隨搖） 10%鎢酸鈉 0.2 ml（隨加隨搖） 按順序加入離心管，混勻。靜置5min,2

7、500rpm離心10min,2）取3支血糖管操作,1:4磷鉬酸溶液加至25刻度處后，用塑料袋片蓋住管口顛倒混勻，用空白管調(diào)“0”，在620nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，讀取各管光密度值,3）按以下公式計(jì)算葡萄糖含量： 兔正常血糖含量為：135+/-12mg/100ml,測(cè)定管光密度值 標(biāo)準(zhǔn)管光密度值,0.1,100 0.1,測(cè)定管光密度值 標(biāo)準(zhǔn)管光密度值,100,葡萄糖 mg/100ml,注意事項(xiàng),加硫酸、鎢酸鈉時(shí)，要邊加邊搖勻 血糖管使用前不要刷，保持內(nèi)壁干燥！ 一定要等水沸后，再放入血糖管。準(zhǔn)確加熱8min,時(shí)間過(guò)久，呈色較深，反之則淺，均影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 煮沸血糖管時(shí)及之后冷卻時(shí)，均不可搖動(dòng)血糖管，避免空氣進(jìn)入，使銅離子再被氧化，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 先加磷鉬酸2.0ml，再加1：4磷鉬酸至25ml，加樣時(shí)注意不要加錯(cuò)。加入磷鉬酸后顯色不穩(wěn)定，應(yīng)迅速進(jìn)行比色。 分光光度計(jì)使用時(shí)需預(yù)熱20分鐘以上。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不要調(diào)節(jié)波長(zhǎng)，造成其它組測(cè)定時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤。 血濾液內(nèi)除葡萄糖外尚含有其他還原性物質(zhì)（約占1020%）。用此法測(cè)得之血糖含量較實(shí)際葡萄糖含量稍高,無(wú)蛋白濾液中的葡萄糖和堿性硫酸銅溶液共熱反應(yīng)，Cu2+即被葡萄