免疫組化中的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照如何設(shè)置

1、.免疫組化中的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照如何設(shè)置問(wèn)題：免疫組化中的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照如何設(shè)置？參考見解1：陽(yáng)性對(duì)照：已知含有要測(cè)的抗原的組織。陰性對(duì)照： 可以做幾種：空白對(duì)照：免去一抗 代替對(duì)照：免疫前血清代替一抗已知陰性組織 抑制試驗(yàn)：未標(biāo)記抗體要發(fā)文章建議做代替對(duì)照。 參考見解2：樓上回答的真好，不過(guò)組織內(nèi)對(duì)照的合理使用可以免去設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照的很多麻煩！問(wèn)題：免疫組化技術(shù)(IHC)的優(yōu)點(diǎn)是什么參考見解：1特異性強(qiáng) 免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)

2、胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。 2敏感性高 在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合 該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。免疫組化常見問(wèn)題的處理參考意見： 當(dāng)免疫

3、組化染色沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時(shí)，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。 對(duì)照/標(biāo)本無(wú)染色 確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時(shí)間。 對(duì)照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測(cè)系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點(diǎn)是非常重要的。比如，如果一抗是兔來(lái)源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來(lái)匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在48條件下保存，應(yīng)

4、避免反復(fù)凍融，試劑保存時(shí)一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價(jià)。 檢查標(biāo)本的儲(chǔ)存條件，最好用已知陽(yáng)性的標(biāo)本來(lái)同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照。 檢查色原/底物溶液，最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法是將一滴標(biāo)記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)用完，否則會(huì)失效。 檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過(guò)氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。 檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。弱陽(yáng)性如果陰性對(duì)照沒(méi)有染色而陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本弱陽(yáng)性，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮： 標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r(shí)

5、溫度過(guò)高，都會(huì)影響到所檢測(cè)的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過(guò)程中固定劑對(duì)抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時(shí)使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說(shuō)明，同時(shí)結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。 抗體的稀釋度是否過(guò)高或者孵育的溫度/時(shí)間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會(huì)對(duì)試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來(lái)自各種組織，處理過(guò)程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對(duì)所使用的一抗進(jìn)行梯度測(cè)試，找出最佳的使用濃度。 切片上遺留了過(guò)多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。 孵育時(shí)切片是否放置水平，否則會(huì)導(dǎo)致抗體流失。如果陰

6、性對(duì)照沒(méi)有反應(yīng)，陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽(yáng)性，則可能是由于陽(yáng)性對(duì)照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。非特異性染色 是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對(duì)于內(nèi)源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為： 滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.68.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對(duì)于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。飽和處理內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性生物素，使之不再有剩余的結(jié)合位點(diǎn)。具體方法是在

7、ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。 是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動(dòng)物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點(diǎn)。有時(shí)其它無(wú)關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用。另外，取材時(shí)避開出血、壞死區(qū)亦極重要。最近有些國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進(jìn)行抗原封閉，效果也不錯(cuò)。 所選擇的抗體是否符合試驗(yàn)要求。因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過(guò)采用高純度、高效價(jià)的抗體、或針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來(lái)解決。 一抗的使

8、用濃度是否過(guò)高。 清洗是否充分。應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l TrisHCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內(nèi)加入吐溫20，效果更佳。特殊標(biāo)記時(shí)，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。 DBA的使用是否正確。DAB的孵育時(shí)間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時(shí)，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時(shí)，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過(guò)濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此

9、需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成背景染色。 標(biāo)本染色過(guò)程中是否曾經(jīng)干涸，否則會(huì)造成邊緣部的非特異性染色。 檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)。1、染色過(guò)強(qiáng) 原因解決辦法 A、抗體的濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4過(guò)夜 B、孵育溫度過(guò)高，孵育溫度超過(guò)37 一般室溫20-28 C、DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或DAB濃度過(guò)高 顯色時(shí)間不能超過(guò)5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)2、非特異性背景染色 原因解決辦法 A、操作過(guò)程中沖洗不充分每步?jīng)_洗35 B、組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉

10、，孵育時(shí)間延長(zhǎng) C、組織中含內(nèi)源性生物素正常非免疫動(dòng)物血清再封閉 D、血清蛋白封閉不充分 延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間3、染色弱 原因解決辦法 A、抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)間過(guò)短提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘 B、試劑超過(guò)有效使用期及時(shí)更換試劑 C、操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥） D、室溫太低，低于15若室溫低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分鐘（或4冰箱過(guò)夜） E、蛋白封閉過(guò)度封閉時(shí)間不要超過(guò)10分鐘4、染色陰性原因解決辦法 A、操作步驟錯(cuò)誤重新試驗(yàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照 B、組織中無(wú)抗原設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 C、一

11、抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無(wú)誤【請(qǐng)教】免疫組化陽(yáng)性、陰性對(duì)照的問(wèn)題各位大蝦，我做了大鼠組織的TNF-免疫組化，是取材后送到醫(yī)院病理科出錢代做的，現(xiàn)HE和免疫組化片子已經(jīng)做好，我才意識(shí)到?jīng)]有陽(yáng)性和陰性對(duì)照，請(qǐng)問(wèn)這兩種對(duì)照該怎么弄，是我自己想辦法還是該病理科負(fù)責(zé)給我設(shè)立？需要我自己再買相應(yīng)的試劑嗎？以前沒(méi)有做過(guò)，所以一頭霧水，請(qǐng)不吝賜教，多謝! 免疫組化的同一批片子中要有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照才有意義,這些應(yīng)該是同時(shí)作出來(lái)的,事后無(wú)法補(bǔ)救.陽(yáng)性對(duì)照片在購(gòu)試劑時(shí)可以要求附兩張?jiān)噭┕镜年?yáng)性片子,如果沒(méi)有,也可以自已搞,我做的時(shí)候是用腫瘤組織作陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織不加一抗作陰性對(duì)照,你可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照,不用再購(gòu)買試劑.個(gè)人見解,希望對(duì)你有幫助. 免疫組化染色中的對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下：自身對(duì)照、陰性對(duì)照（空白對(duì)照、替代對(duì)照、抑制對(duì)照、 吸收實(shí)驗(yàn)對(duì)照）、陽(yáng)性對(duì)照。A、自身對(duì)照：在同一切片上與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如Actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽(yáng)性，Vimentin可以間質(zhì)細(xì)胞，Desmin以血管壁及肌束為對(duì)照，S-100以小神經(jīng)末為對(duì)照等，如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織是陽(yáng)性，則技術(shù)操作