植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

1、第六章,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn),1983,年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司在世界,上首次成功地采用紫草細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn),紫草寧,北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司,1,植物次生代謝產(chǎn)物概述,2,細(xì)胞的初代培養(yǎng),3,高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選,4,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法,5,植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn),1.1,植物代謝產(chǎn)物,1,初生代謝,為維持植物正常的生長發(fā)育所必,須的代謝。初生代謝過程中形成的各種產(chǎn)物為初,生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易,發(fā)生轉(zhuǎn)化,2,次生代謝,建立在初生代謝基礎(chǔ)上，對于植,物的正常生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物為,次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物是末端代謝產(chǎn)物,比較穩(wěn)定，可以在體

2、內(nèi)積累,類別,次生代謝產(chǎn)物,用途,黃酮,銀杏黃酮，大豆黃酮,治療心血管疾病,醌,紫草寧,抗菌、抗炎、抗病毒、止血,簡單酚類,香豆素,香料，抗菌消炎,萜,類,紫杉醇,抗癌,青蒿素,抗瘧疾,生,物,堿,長春新堿,抗癌,奎寧,抗瘧疾,酚,類,化,合,物,長春堿,2 million/kg,長春新堿,15million/kg,李時珍在本草綱目中所開列的,1892,種藥物,絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約,25,的法定,藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn),物。天然的次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過,2,萬種,次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用：色素、香料、藥物、添加,劑、工業(yè)原料等,紫杉醇：二萜類化合物,最早由太平洋紅豆杉,Ta

3、xus,brevifolia,的樹皮中分,離,廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌,等十幾種癌癥,目前主要來源于紅豆杉屬植物,紫杉醇簡介,市場需求,抗癌一線用藥,銷售額,年增長率,5,億美元,理論需求量,2g,人,500,萬人,年,1000kg,年,實(shí)際銷量,350 kg,年,紫杉醇供需相差十分懸殊,0.8,3.4,6.6,12,14.8,18.2,20,25,0,5,10,15,20,25,30,1992,1994,1995,1998,1999,2000,2001,2002,300,350,480,620,780,1000,0,200,400,600,800,1000,2000年,200

4、2年,2004年,需求量,圖,1,國際紫杉醇原料藥需求走勢圖（單位：公斤,圖,2,國際紫杉醇銷售額（億美元,藥源問題,紅豆杉,主要原料植物,國家一級保護(hù)野生植物，全球十大瀕危物,種之一,生長緩慢,分布有限,Taxol,含量低,樹皮中,Taxol,含量,0.00001-0.069,3000,棵樹,10,噸樹皮,1kg Taxol=500,病人,700,歲的紅豆杉慘遭剝皮,人工栽培,采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉,幼苗,尋找紅豆衫的替代物,從紅豆杉非樹皮部位提取,產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物,藥源問題解決辦法（一,藥源問題解決辦法（二,化學(xué)合成,全合成,1994,年獲得成功,

5、現(xiàn)有六種途徑,半合成,以,10-DAB,和,Baccatin,作為半合成原料獲得紫杉醇,藥源問題解決辦法（三,生物方法,組織和細(xì)胞培養(yǎng),微生物發(fā)酵,生物合成,研究階段,紅豆杉生物合成途徑基本明確,10,種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá),利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量,1.2,獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法,從植物中提取,化學(xué)合成,植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,植物細(xì)胞具有,形態(tài)全能性，化學(xué)全能性,在離體的條件下可以合成整株植物能合成的物質(zhì),自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較,生產(chǎn)方式,生產(chǎn)周期,紫草寧含量（干重,完整植物,2,3,年,1,2,植物細(xì)胞培養(yǎng),3,周,14,細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)次生代謝

6、產(chǎn)物的理想途徑,縮短周期，提高生產(chǎn)效率,植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)周期為,15-30d,而完整植株生長短則幾個月,長則數(shù)年，如木瓜,8,個月，而紫草為,5,年,易于管理，減輕勞動強(qiáng)度,培養(yǎng)在無菌條件下進(jìn)行，可排除病蟲害干擾,可探索新的合成路線，獲得新的有用物質(zhì),1.3,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng),即是將植物細(xì)胞或小,的細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),的技術(shù),成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足,3,個條件,分散性良好,細(xì)胞團(tuán)較小，一般在,30,50,個細(xì)胞以下，在實(shí),際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系,細(xì)胞分裂快，均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸,浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)

7、胞色澤呈,鮮艷的乳白或淡黃色,有效成分含量高,次生產(chǎn)物的產(chǎn)量,細(xì)胞量,細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率,可控,遺傳因素決定,植物細(xì)胞培養(yǎng)具有,周期長、細(xì)胞抗剪切能,力弱、易聚團(tuán),等特點(diǎn),植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計不僅要考慮有,利于細(xì)胞生長，還要考慮有利于,產(chǎn)物的積累,和分離,適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有,適宜,的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力,2,細(xì)胞的初始培養(yǎng),實(shí)驗中獲得適宜于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系的過程,稱為細(xì)胞的初始培養(yǎng),2.1,建立懸浮系,獲取懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞的振蕩培養(yǎng),酶解法,愈傷組織培養(yǎng)法,使細(xì)胞團(tuán)分散,促進(jìn)氣體交換,攪拌培養(yǎng),旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng),旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),培養(yǎng)方式,2.2,建立良好的懸浮系的關(guān)

8、鍵環(huán)節(jié),1,選擇適宜的外植體,雙子葉植物,幼胚,成熟胚、下胚軸、葉片,單子葉植物,幼胚,成熟胚、幼穗、花藥等,2,誘導(dǎo)疏松愈傷組織,培養(yǎng)基,愈傷組織的異質(zhì)性,繼代培養(yǎng),3,選擇適宜的培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基,CTK/AUX,天然復(fù)合物,eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE,培養(yǎng)基的,PH,李忠光，龔明,2006.7,4,懸浮培養(yǎng)初期的控制,轉(zhuǎn)速，光，溫度,5,懸浮細(xì)胞的繼代與選擇,繼代中收集小的細(xì)胞團(tuán),條件培養(yǎng)基：新鮮培養(yǎng)基,3,高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選,P113,3.1,高產(chǎn)細(xì)胞系,篩選的整體思路,外植體,愈傷組織的誘導(dǎo)篩選,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,高產(chǎn)細(xì)胞系篩選,高產(chǎn)細(xì)胞系的建立,高產(chǎn)細(xì)胞株系的特點(diǎn),

9、培養(yǎng)細(xì)胞在,遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定,的，以得到產(chǎn)量恒定,的產(chǎn)物,細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成的,速度快,在較短的時間內(nèi),能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物,代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累，而不被迅速分解，最,好能將其,釋放到培養(yǎng)基,中,高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選過程,選定特定起始材料,準(zhǔn)確選擇能夠產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物的植物種類、品種或單株,應(yīng)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織或器官為外植體,誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得單細(xì)胞懸浮液,誘變處理細(xì)胞懸浮液，篩選目的突變細(xì)胞,通過單細(xì)胞培養(yǎng)突變細(xì)胞，獲得突變細(xì)胞無性系,即突變細(xì)胞愈傷組織獲得,高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選方法,目測法,注意：真正的變異體,or,生理狀態(tài)不同的細(xì)胞克隆,根據(jù)單細(xì)胞克隆次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行篩

10、選,抗性篩選,如：添加抗性抑制劑,庚二酸,生物素,誘變篩選,3.2,高產(chǎn)系的穩(wěn)定性及保存方法,盡量減少繼代次數(shù)，用礦物油包埋法，低溫保,存法,0-4,，超低溫保存法,196,保,存,同時從高產(chǎn)系中不斷克隆形成新的高產(chǎn)細(xì)胞系,4,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法,懸浮培養(yǎng),將游離的細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)按一定密度，懸浮在液,體培養(yǎng)基中，不斷攪拌或者振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞快速、大量,增殖,技術(shù)難點(diǎn),通氣、剪切力的適應(yīng)性；細(xì)胞同步化控制,培養(yǎng)：培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基,CTK/AUX,培養(yǎng)條件：溫度、氧氣,PH,轉(zhuǎn)速,同步化控制,細(xì)胞增殖的監(jiān)測，適時測定細(xì)胞的數(shù)量，掌握放罐時機(jī),4.1,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法,P,117,分批培養(yǎng)法

11、,連續(xù)培養(yǎng)法,半連續(xù)培養(yǎng)法,細(xì)胞固定化培養(yǎng),分批培養(yǎng),把細(xì)胞分散在一定溶積的培養(yǎng)基中,進(jìn)行培養(yǎng),注：中途不添加也不更換培養(yǎng)基,設(shè)備簡單，操作方便，重復(fù)性好,適合與突變體篩選和遺傳轉(zhuǎn)化的研究,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線,時間,d,細(xì),胞,數(shù),量,1,2,3,4,5,1,滯后期,2,對數(shù)生長期,3,直線生長期,4,減緩期,5,靜止期,1,細(xì)胞擴(kuò)增生長成,S,形曲線,2,繼代培養(yǎng),要求縮短滯后期,滯后期的長短,a,繼代細(xì)胞所處的生長時期；對數(shù)期,b,繼代的細(xì)胞密度,10,4,10,5,個,ml,連續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng),器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時以,一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基及培養(yǎng)物的方式

12、,加入培養(yǎng)基,排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,半連續(xù)培養(yǎng),在完成分批培養(yǎng)的一個周期,后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只,保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的,種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),的方式,細(xì)胞固定化培養(yǎng),將細(xì)胞固定在固相基質(zhì)上,放入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的方式,懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器的類型,機(jī)械攪拌式反應(yīng)器,氣動式反應(yīng)器,內(nèi)循環(huán)氣升式,外循環(huán)氣升式,機(jī)械攪拌式,內(nèi)循環(huán)氣升式,外循環(huán)氣升式,4.2,培養(yǎng)基：與培養(yǎng)的細(xì)胞密度相關(guān),1,高密度懸浮系,5*10,4,個,ml,a,用,B5,ER,等專用培養(yǎng)基,b,對傳統(tǒng)培養(yǎng)基做出改良,如：加大,2,4-D,用量；改良,MS,加入,VB,CH,等,天然復(fù)合物,2

13、,低密度懸浮系,5*10,4,個,ml,a,條件培養(yǎng)基,b,向培養(yǎng)基中添加多種成分，盡可能滿足細(xì),胞生長的需要,細(xì)胞同步化,同一懸浮培養(yǎng)體系的大多數(shù)細(xì)胞,都同時通過細(xì)胞周期的某一特定時期,細(xì)胞培養(yǎng)的同步化方法,饑餓法：限制必需物質(zhì)的供應(yīng),抑制法：化學(xué)抑制，物理抑制,分級培養(yǎng)：細(xì)胞分級儀,4.3,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化,P,121,4.4,懸浮細(xì)胞的生長量和活力分析,P122,1,測定懸浮細(xì)胞數(shù)量的方法,細(xì)胞計數(shù),血球計數(shù)板,鮮重、干重的測定,細(xì)胞密實(shí)體積,PVC,2,細(xì)胞活力測定,二乙酸熒光素法,FDA,活細(xì)胞內(nèi)有熒光產(chǎn)生,伊凡蘭染色法,染色受損細(xì)胞核,死細(xì)胞,相差顯微鏡法,胞質(zhì)環(huán)流是否存在,5

14、,植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì),植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求,從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長,和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng),從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下,3,個條件,1,培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物,2,細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高,產(chǎn)量的終產(chǎn)物,3,代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放,到培養(yǎng)基中,5.1,技術(shù)路線,1,選擇適宜的外植體；誘導(dǎo)疏松愈傷組織,2,通過含量分析，選擇高產(chǎn)細(xì)胞系,3,研究培養(yǎng)條件（達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn),4,建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件,達(dá)到高

15、產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn),5,小試、中試、優(yōu)化培養(yǎng)條件,6,大規(guī)模培養(yǎng),7,工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品分離，純化,5.2,提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法,1,篩選高產(chǎn)細(xì)胞系,不同植物種類，不同植株及同一植株的不,同部位，往往有不同的代謝能力,通過人工誘變改良細(xì)胞系,通過遺傳改良篩選細(xì)胞系,云,南,紅,豆,杉,東北紅豆杉,中國紅豆杉,南方紅豆杉,雜種紅豆杉,篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有,的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定,多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因,此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量,增長，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物,故在生長的第一階段使用,生長培養(yǎng)基,第二階段使,用,生產(chǎn)培養(yǎng)基,一般來說增加培養(yǎng)基的,N,P,和,K,濃度能促進(jìn)細(xì)胞,生長，而適當(dāng)增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成,而激素需根據(jù)實(shí)驗確定,適于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要是,B5,和,ER,2,優(yōu)化培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基,激素,天然復(fù)合物,3,改善培養(yǎng)條件,對于任何一種細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件都要通過,多次的試驗摸索確定,eg,在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫,紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫,條件下，生成量高,4,培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì),在細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)是以初生代謝物質(zhì)為原,料，經(jīng)過