肝臟缺血再灌注損傷探究進(jìn)展

1、肝臟缺血再灌注損傷探究進(jìn)展 摘要 肝臟缺血再灌注是臨床上常見的病理現(xiàn)象，近年的研究發(fā)現(xiàn)鈣超載與氧化應(yīng)激和多種炎癥因子在再灌注損傷中起著重要作用，Kupffer細(xì)胞和一氧化氮分子同時(shí)具有保護(hù)和加重?fù)p傷雙重作用。 關(guān)鍵詞肝臟;缺血再灌注損傷； 機(jī)理 中圖分類號(hào) R333.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B文章編號(hào) 1005-0515（2011）-02-271-02 Abstract The hepatic ischemia-reperfusion injury is one common clinical pathologic event.Recent studies have indicated that cal

2、cium-overloading, oxidative stress and various inflammative cytokines play very important roles in the ischemia-reperfusion injury, while Kupffer cells and nitric oxide exhibit double-edge effects with protection or exacerbation in the ischemia-reperfusion injury process. Keywords: Liver; Ischemia-r

3、eperfusion injury; Mechamism. 肝臟缺血再灌注損傷（IRI）是臨床上常見的病理現(xiàn)象，在肝移植、肝臟腫瘤切除手術(shù)、大出血、休克等過程都伴隨IRI的發(fā)生。雖然其機(jī)制尚未完全明確，但是對其許多環(huán)節(jié)的研究已經(jīng)有了突破性的進(jìn)展。 1 肝臟IRI的鈣超載與氧化應(yīng)激 在缺血狀況下，細(xì)胞的內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列變化，其中最顯著的是由于缺氧而導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)部鈣超載。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+的濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，維持這個(gè)離子梯度需要多種離子泵的作用，如鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶以及鎂ATP酶。缺血缺氧的條件下細(xì)胞有氧呼吸受阻，僅依賴無氧酵解葡萄糖產(chǎn)生ATP并不足以維持這些離子泵

4、的運(yùn)轉(zhuǎn)，細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度梯度便會(huì)遭到破壞。而且無氧呼吸產(chǎn)生的乳酸因?yàn)闊o法通過血液循環(huán)離開組織而堆積，造成細(xì)胞內(nèi)外的酸化，也會(huì)降低甚至損傷離子泵的功能。離子泵功能下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而這又會(huì)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的Ca2+的釋放，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Na離子濃度升高是Na/Ca交換體活性上升，進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升1。Ca2+作為第二信使，它的濃度升高會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)部一系列變化，尤其是酶的激活，也正是這些酶的激活引起了許多細(xì)胞損傷。首先，Ca2+可以激活鈣依賴蛋白酶催化黃嘌呤脫氫酶（XDH）轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶(XOD)，XOD在有氧的情況下可以催化次黃嘌呤分解并產(chǎn)生大量的自由基，是再灌注損傷中

5、自由基的重要來源之一2；其次，Ca2+的內(nèi)流還會(huì)使高電導(dǎo)性通道-通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore,PTP）開放，改變了線粒體膜的通透性，使線粒體內(nèi)的鈣釋放入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步加重鈣超載，也會(huì)造成線粒體嵴和外膜等膜結(jié)構(gòu)的破壞4。線粒體的破壞會(huì)釋放其中的cyt-C、AIF、Smac/DIABLO等蛋白，這些蛋白可以通過caspase途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡3。而且缺乏cyt-C的線粒體在有氧狀況下電子傳遞受阻不但無法產(chǎn)生ATP，反而會(huì)生成大量自由基破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死2；最后，鈣激活的磷脂酶、核酸內(nèi)切酶也會(huì)損傷細(xì)胞，引發(fā)凋亡和壞死5。 再灌注時(shí)的氧化應(yīng)激也是引

6、發(fā)細(xì)胞損傷的重要原因，自由基的來源除了XOD和線粒體外，還由Kupffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生。細(xì)胞和組織中原有的抗自由基分子如GSH和SOD等不足以應(yīng)對大量的自由基，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)、吡啶堿基和蛋白質(zhì)遭到氧化，而且自由基會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)抗中性粒細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)6，再加上鈣超載等因素最終使細(xì)胞膜以及線粒體膜的通透性改變，引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。而且自由基還會(huì)激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-B，使其從與I-B的結(jié)合狀態(tài)下被釋放，而后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，在Kupffer細(xì)胞中會(huì)引發(fā)其釋放IL-6、TNF-等細(xì)胞因子,在血竇內(nèi)皮細(xì)胞中則會(huì)上調(diào)其表面ICAM-1、P-Selectin等粘附分子的表達(dá)，加重后續(xù)的炎

7、癥反應(yīng)7。 2 肝臟IRI的分期 目前在缺血再灌注損傷的研究中，再灌注損傷主要分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段是再灌注開始到6個(gè)小時(shí)以內(nèi)的急性損傷。這個(gè)階段肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死主要由自由基和TNF-介導(dǎo)。同時(shí)，Kupffer細(xì)胞分泌趨化因子，內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子的表達(dá)會(huì)上調(diào)，其機(jī)理見前述；第二個(gè)階段是從6小時(shí)之后24小時(shí)之內(nèi)，這個(gè)階段肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷主要由中性粒細(xì)胞造成的。這些中性粒細(xì)胞大多是被趨化因子募集而來，被內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子捕獲并滲透進(jìn)入肝臟實(shí)質(zhì)。在Kupffer細(xì)胞分泌的IL-1、IL-6以及TNF-等細(xì)胞因子的作用下活化，產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng)，其呼吸爆發(fā)會(huì)產(chǎn)生的大量的自由基，同時(shí)會(huì)

8、分泌蛋白酶和細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致大量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞喪失功能或者死亡8。 3 肝臟IRI中的重要細(xì)胞 Kupffer細(xì)胞的作用也早有描述，在再灌注之前，由于內(nèi)皮細(xì)胞的部分凋亡的刺激，作為肝組織中的單核吞噬細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞就已經(jīng)開始分泌促炎癥的細(xì)胞因子了。而再灌注時(shí)，更多的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、組織中自由基含量的升高以及補(bǔ)體的激活會(huì)活化Kupffer細(xì)胞，使其吞噬能力增強(qiáng)，并誘導(dǎo)其分泌TNF-、IL-1、IL-6和CXC等，引發(fā)炎癥反應(yīng)3，因此多數(shù)人認(rèn)為Kupffer細(xì)胞在IRI中扮演著負(fù)面的角色。但是近期的研究發(fā)現(xiàn)，在再灌注損傷中，完全的去除Kupffer細(xì)胞反而會(huì)加劇炎癥和損傷，這說明Kupffe

9、r細(xì)胞也能起到保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究表明，是在肝臟中定居的Kupffer細(xì)胞而不是血液中游走的單核細(xì)胞起到了保護(hù)作用，它們通過分泌HO-1，來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向自穩(wěn)態(tài)方向分化，使巨噬細(xì)胞的促炎癥作用被抑制9。而這類定居于肝臟的Kupffer細(xì)胞中只有Hmox+/-和Hmox+/+兩種亞型才有分泌HO-1的功能，而Hmox-/-型Kupffer細(xì)胞并沒有這種保護(hù)作用10。 T細(xì)胞在募集中性粒細(xì)胞的過程中起著重要的作用。在T細(xì)胞缺陷的動(dòng)物體內(nèi)，再灌注時(shí)中性粒細(xì)胞的募集明顯受阻，而補(bǔ)充CD4+T細(xì)胞則會(huì)基本恢復(fù)中性粒細(xì)胞的募集，補(bǔ)充CD8+T細(xì)胞則沒有這種效果，這說明CD4+而不是CD8+的T細(xì)胞在中性

10、粒細(xì)胞的募集中起著重要的作用11。不過傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中CD4+T 的激活需要抗原的存在和APC細(xì)胞的抗原加工和提成，但是實(shí)驗(yàn)中并沒有外來抗原的存在，而且CD4+T細(xì)胞在再灌注開始后的1小時(shí)內(nèi)即被迅速被募集到該區(qū)域，這說明在再灌注損傷中CD4+T細(xì)胞是由于細(xì)胞因子的作用而發(fā)生了不依賴抗原的激活，或者是由于體內(nèi)自身抗原受到自由基損傷后成為了抗原12。CD4+T細(xì)胞在被激活后會(huì)釋放如TNF-、IFN-和G-CSF等細(xì)胞因子，從而進(jìn)一步放大Kupffer引發(fā)炎癥和募集中性粒細(xì)胞的作用，但T細(xì)胞是否在激活Kupffer細(xì)胞起決定作用上尚不清楚11。 血竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)作為肝臟循環(huán)系統(tǒng)中的重要組成部分，在I

11、RI中扮演著重要的角色。首先，它作為直接接觸血液的細(xì)胞，所經(jīng)歷的氧濃度變化最為劇烈，發(fā)生凋亡早于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，甚至在再灌注之前就已經(jīng)有少部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。其損傷機(jī)制如前述主要是由于鈣超載和自由基引起的一系列對于線粒體和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；其次，SEC不但維持著正常的血管結(jié)構(gòu)，還具有重要的分泌功能。組織中的NO有兩個(gè)來源，第一個(gè)是由血竇內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶（eNOS）產(chǎn)生，這部分NO對于維持血管舒張有著重要作用的；第二個(gè)來源是誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS），即各種細(xì)胞在一定條件下誘導(dǎo)而分泌的NO。再灌注開始時(shí)可檢測到NO濃度降低、內(nèi)皮素（ET）釋放量增加。NO可以舒張血管而ET有很強(qiáng)的縮血

12、管作用，但ET的分泌受到NO等物質(zhì)的抑制。在再灌注的情況下，組織中的NO含量下降使ET所受到的限制減少，引起血管強(qiáng)烈收縮而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，嚴(yán)重影響了肝臟細(xì)胞恢復(fù)其正常功能并誘發(fā)該區(qū)域壞死。再灌注時(shí)NO能夠通過生成過硝酸鹽中和自由基，降低自由基的濃度，進(jìn)而減弱自由基活化NF-B的作用。NO含量的增加就可以減少炎癥因子的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的粘附和滲透作用，這可能就是NO抗炎癥的途徑之一。另外，一些研究也發(fā)現(xiàn)NO可以促進(jìn)cGMP的生成，cGMP濃度的上升可以舒張血管改善血液循環(huán)，而且cGMP還能減少中性粒細(xì)胞的募集，但這種抗炎癥作用的機(jī)理目前并不清楚，因?yàn)镮L-6的分泌并不因?yàn)閏GMP含量的增加而減少

13、14。iNOS mRNA的大量表達(dá)產(chǎn)生的NO與自由基反應(yīng)雖然能夠中和一部分自由基，但是在再灌注條件下，細(xì)胞普遍表達(dá)iNOS mRNA和大量的自由基反應(yīng)會(huì)引發(fā)過硝酸鹽的損傷15。另一方面，如果完全阻斷NO的生成卻會(huì)使再灌注損傷更加嚴(yán)重，這是因?yàn)樽钄鄀NOS會(huì)失去它對抗血管收縮和炎癥的作用16。 最后，正常時(shí)SEC表面ICAM-1的很少，但再灌注后，在NO、自由基和TNF-等細(xì)胞因子的作用下ICAM-1等粘附分子表達(dá)明顯上升，使其免疫粘附作用加強(qiáng)，對于后續(xù)的中性粒細(xì)胞的募集起了至關(guān)重要的作用17。 4 肝臟IRI的對策與前景 雖然IRI的機(jī)制很復(fù)雜，但是在臨床上已經(jīng)有了一些對策。目前最廣泛使用的也

14、是有效的就是缺血預(yù)處理（IPC），即在手術(shù)前先對會(huì)缺血的區(qū)域進(jìn)行短時(shí)間的缺血和再灌注，由于時(shí)間較短所以不會(huì)引起太大損傷，但卻可以明顯的增強(qiáng)組織對于缺血的耐受力，因而對于較短時(shí)間的缺血（1-2小時(shí)之內(nèi)）能起到很好的減輕損傷作用。IPC的機(jī)制十分復(fù)雜，也是目前的研究的熱點(diǎn)。一些研究證實(shí)，腺苷A1受體（A1R）的阻斷劑能極大的抵消IPC的作用，這說明，IPC可能是通過激活A(yù)1R等受體，降低細(xì)胞中腺苷的濃度，減少黃嘌呤氧化酶催化的底物，也就減少了自由基的生成18。另外也有發(fā)現(xiàn)證實(shí)IPC起到保護(hù)作用也可能是通過促進(jìn)HO-1的分泌來達(dá)到的10。當(dāng)然IPC的作用不止如此，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到的Ca超載的減輕等

15、現(xiàn)象不能完全通過這些途徑來解釋，但是這些研究給我們研究IPC的機(jī)制帶來了新的思路。 另外，間斷肝門阻斷（intermittent portal triad clamping ,IC）也是一種有效的減輕IRI的手段，即術(shù)中每隔15-30分鐘的缺血后進(jìn)行5分鐘的灌注，這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間的缺血并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生大量死亡。在大于75分鐘的手術(shù)中IC對肝臟的保護(hù)作用要強(qiáng)于IPC，尤其對于有肝硬化等病變的患者效果更為明顯。但是，這種方法帶來的失血也是一個(gè)不小的問題19。 如果能用藥物控制鈣超載、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子、中性粒細(xì)胞的募集等某個(gè)環(huán)節(jié)，減輕再灌注損傷，就可以極大的降低手術(shù)的難度和病人的危險(xiǎn)。但是這

16、些環(huán)節(jié)中所隱藏的機(jī)理很多都沒有被完全揭示，而且相關(guān)的分子在再灌注損傷中的作用往往是十分復(fù)雜的，如NO的雙重作用，簡單的使用藥物增加或減少它們都不能得到滿意的效果。所以仍然需要大量的研究來揭示其中的聯(lián)系，從多個(gè)方面入手，綜合解決再灌注損傷的問題。 參考文獻(xiàn) 1 Sch?fer C,Ladilov Y, Inserte J, Sch?fer M, Haffner S, Garcia-Dorado D, Piper HM. Role of the reverse mode of the Na+/Ca2+ exchanger in reoxygenation-induced cardiomyocyte

17、 injury J. Cardiovasc Res, 2001, 51(2):241-250. 2 Jaeschke, H, and Mitchell JR. Mitochondria and xanthine oxidase both generate reactive oxygen species after hypoxic damage in isolated perfused rat liver J . Biochem Biophys Res Commun, 1989, 160: 140-147. 3 杜津, 陶國才. 肝臟缺血/再灌注后線粒體損傷與促凋亡蛋白的釋放 J. 國際麻醉學(xué)與

18、復(fù)蘇雜志, 2007, 28(1):79-82. 4 Belous A, Knox C, Nicoud IB , Pierce J, Anderson C, Pinson CW, Chari RS. Altered ATP-dependent mitochondrial Ca2+ uptake in cold ischemia is attenuated by ruthenium red J. J Surg Res, 2003, 111(2):284-289. 5 岳媛媛,馮志杰. 肝臟缺血再灌注損傷與鈣超載J. 世界華人消化雜志, 2008, 16(32): 3654-3658. 6 Wei

19、ss, SJ. Tissue destruction by neutrophils J. N Engl J Med, 1989, 320:365-376. 7 Jaeschke,Hartmut. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning J. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003,284: 15-26. 8 Lentsch AB, Kato A, Yoshidome H, McMasters KM, Edwards MJ.

20、Inflammatory mechanisms and therapeutic strategies for warm hepatic ischemia/reperfusion injury J. Hepatology, 2000, 32(2):169-173. 9 Vile GF, Basu-Modak S, Waltner C, Tyrrell RM. Heme oxygenase 1 mediates an adaptive response to oxidative stress in human skin fibroblasts J. Proc Natl Acad Sci U S A

21、, 1994, 91(7):2607-2610. 10 Devey L, Ferenbach D, Mohr E. Tissue-resident macrophages protect the liver from ischemia reperfusion injury via a heme oxygenase-1-dependent mechanism J. Mol Ther, 2009, 17(1):65-72. 11 Zwacka RM, Zhang Y, Halldorson J, Schlossberg H, Dudus L,Engelhardt JF. CD4(+)T-lymph

22、ocytes mediate ischemia/reperfusion-induced inflammatory responses in mouse liver J. J Clin Invest, 1997, 100(2):279-289. 12 Caldwell CC, Tschoep J, Lentsch AB.J Leukoc Biol. Lymphocyte function during hepatic ischemia/reperfusion injury J. 2007, 82(3):457-464. 13 Horie Y, Wolf R, Granger DN. Role o

23、f nitric oxide in gut ischemia-reperfusion-induced hepatic microvascular dysfunction J. Am J Physiol, 1997, 273(5 Pt 1):G1007-13. 14 Cottart CH, Nivet-Antoine V, Do L. Hepatic cytoprotection by nitric oxide and the cGMP pathway after ischemia-reperfusion in the rat J. Nitric Oxide, 2003，9(2):57-63. 15 Wang LM, Tian XF, Song QY. Expression and role of inducible nitric oxide