核酸的生物化學幻燈片

1、核酸的生物化學,李金明 衛(wèi)生部臨床檢驗中心,核酸(Nucleic acid)?,愚蠢的分子?,核苷酸的簡單排列,蛋白質(zhì)的豐富多彩,A是B的DNA,這里B不是生物體 A不是DNA 這句話想說的是:A是B的本質(zhì)、精華,核酸研究的歷史,核酸研究的歷史,不久，科塞爾（Albrecht Kossel）發(fā)現(xiàn)“核素”是蛋白和核酸的復合物，并明確了核酸各組成成分的比例(核酸化學領域的第一縷曙光),Friedrich Miescher,Albrecht Kossel (獲1910年諾貝爾生理學醫(yī)學獎),1869 米舍爾（Friedrich Miescher 從膿球分離出細胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“

2、核素” (nuclein),核酸研究的歷史,1911 科塞爾的學生萊文(P.A.T. Levine）證明核酸中所含的糖由5個碳原子所組成，命名為核糖闡明了胸腺組織和酵母中分離到的核酸的不同,前者為脫氧核糖核酸(DNA), 后者為核糖核酸（RNA）。,核酸研究的歷史,1934 萊文發(fā)現(xiàn)核酸可被分解成含有一個嘌 呤或嘧啶、一個核糖或脫氧核糖和一個磷酸的片段，這樣的組合叫“核苷酸”。 他們根據(jù)當時比較粗糙的分析認為，4種堿基 在核酸中的量相等，從而錯誤地推導出核酸的基本結構是由4個含不同堿基的核苷酸連接成四核苷酸，以此為基礎聚合成核酸，這就是較著名的“四核苷酸假說”。,核酸研究的歷史,1944 美國

3、微生物學家埃弗里（O.T. Avery ）等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗,O.T. AVERY,核酸研究的歷史,Erwin Chargaff,1950 查伽夫（Erwin Chargaff） et al- Chargaff法則,核酸研究的歷史,1952 赫爾希和蔡斯（HERSHEY, CHASE）-噬菌體標記實驗,Alfred Hershey and Martha Chase,核酸研究的歷史,1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA雙螺旋,Francis Crick and James Watson (獲1962年諾貝爾生理學醫(yī)學獎),Maurice Hugh Frederick Wi

4、lkins,Rosalind Franklin,為什么是這兩個年輕人？,沃森：生物學，研究噬菌體 克里克：物理學、化學 不是因為勤奮（成績平平），而是因為其獨有的想像力。,沃森和克里克卻是“站在巨人的腳趾上” -布拉格在為雙螺旋寫序時，戲稱他們。,我之所以能夠看得更遠，是因為我站在巨人的肩膀上。 - 牛頓,“因為他們連跑上巨人的肩膀上功夫都沒花”,核酸研究的歷史,1955 托德(Alexander Robertus Todd)用磷酸三酯法合成了二核苷酸TpT 這是人工合成DNA大分子的前奏,Alexander Robertus Todd (獲1957年諾貝爾化學獎),核酸研究的歷史,1960年

5、代中期 桑格(Sanger)的DNA測序法,Frederick Sanger (獲1958和1980年諾貝爾化學獎),核酸研究的歷史,1972 伯格(Paul Berg) 重組DNA技術 引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambda的重組 1973 博耶（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重組DNA技術首次得到了重組DNA微生物(基因工程技術),Paul Berg (獲1980年諾貝爾化學獎),Herbert Boyer and Stanley Cohen,核酸研究的歷史,1983 穆利斯（Kary Mullis) PCR技術,核酸研究的歷史,1990 Hum

6、an Genome Project,后基因組時代-基因組學,功能基因組學 研究的核心問題有：基因組的多樣性（SNP、藥物基因組學）；基因組的表達及其時空調(diào)節(jié)（基因芯片、蛋白質(zhì)組學等）；模式生物基因組研究（基因剔除）等,后基因組時代-基因組學,結構基因組學 結構基因組學，是由結構生物學與功能基因組學緊密結合所產(chǎn)生的，其科學目標就是要規(guī)?；販y定蛋白質(zhì)、RNA及其它生物大分子的三維結構。,核酸的種類,DEOXYRIBONUCLEIC ACID（DNA） RIBONUCLEIC ACID（RNA） ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA

7、(mRNA),核酸的分布,DNA RNA 核（%） 98 90,核酸的含量,DNA恒定 RNA與細胞生長狀態(tài)有關,核酸的功能,DNA-遺傳 RNA-參與蛋白質(zhì)合成,核酸的分子組成,元素組成 C H O N P （恒定，910%） 基本結構單位核苷酸,n核苷酸（nucleotide), 核酸多聚核苷酸（polynucleotides),磷酸,核苷（nucleoside),戊糖-ribose(R) deoxyribose(dR),堿基 A G U C A G T C,DNA、RNA組成異同,RNADNA 戊糖核糖脫氧核糖 Adenine (A)Adenine (A) 堿基 Cytosine (C)

8、Cytosine (C) Uracil (U)Thymine (T) Guanine (G)Guanine (G) 鏈的數(shù)量常為單鏈雙鏈 熱穩(wěn)定性?不穩(wěn)定穩(wěn)定,Adenine,Cytosine,Guanine,Thymine,核糖和磷酸,Deoxyribose,Phosphoric Acid,O,核苷、核苷酸,其它核苷酸:NAD(輔酶I)、FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)、cAMP、cGMP、5-FU、6-MP,2、3、5NMP(一磷酸核苷)， 3、5dNMP， 主要是5NMP、dNMP，DNARNA組成 NTPdNTP NDPdNDP 多磷酸核苷酸，能量代謝 環(huán)核苷酸 cAMP、cGMP 第二信

9、使 NADNADP FADFMN 輔酶，生物氧化 抗代謝藥物 6MP，5-FU,核酸的分子結構,核酸的一級結構,5 end,3 end,核苷酸的連接3,5磷酸二酯鍵,表示法 pCpCpA pC-C-A 5-CCA-3,DNA的分子結構,DNA的堿基組成（CHARGAFF法則） 有種屬特異性 無組織、器官特異性 不受年齡、營養(yǎng)和環(huán)境的影響 不論種屬、組織來源，所有DNA分子 A T、G C A/T G/C 1 A + G T + C,DNA 的分子結構,Hydrogen Bonds,Cytosine,Adenine,Thymine,Guanine,Deoxyribose (Sugar molec

10、ule),Phosphoric Acid (Phosphate molecule),DNA的二級結構雙螺旋結構,Watson, Crick （1953）在Chargaff法則及Wilkins,Franklin的X線衍射工作基礎上提出DNA的double helix結構模型 DNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞成雙螺旋結構，螺旋的一側為大溝，另一側為小溝。 磷酸脫氧核糖形成的長鏈骨架在外，堿基在內(nèi)，兩平行鏈對應堿基間以氫鍵相連；對應堿基總是A=T、G = C配對（base pairing)或互補，形成穩(wěn)定聯(lián)系。 各堿基平面垂直或基本垂直于雙螺旋中心軸

11、，鏈內(nèi)堿基間形成縱向Vander Waals力與長軸平行，使雙螺旋更穩(wěn)定。 相臨堿基對間距離為0.34nm,每周螺距為3.4nm (10bp), d為 2nm (B型）,DNA double helix類型,helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18A,DNA的高級結構,超螺旋 如線粒體DNA 細菌質(zhì)粒DNA 病毒DNA,DNA的高級結構,核小體結構：由D

12、NA和組蛋白共同構成 2 (H2AH2B H3 H4 )/DNA(146bp) =核心顆粒 超螺線管染色質(zhì)：由核心顆粒與連接區(qū)構成的核小體彼此串聯(lián)，成串珠狀，再進一步卷曲，形成超螺線管結構。,RNA的分子結構,RNA的種類：tRNA、rRNA、mRNA RNA的堿基組成： A U G C 稀有堿基（假尿嘧啶、甲基化堿基） RNA的一級結構：核苷酸序列 3,5磷酸二酯鍵連接 RNA高級結構,tRNA的結構,一級結構 7090 nt 二級結構 三葉草形狀： 特點（1）氨基酸臂：3CCA-OH結構可與活化的氨基酸結合。（2）DHU環(huán)（二氫尿嘧啶）。（3）反密碼環(huán)：可與mRNA中三聯(lián)體構成反密碼子，在

13、蛋白合成中起解讀密碼子，將對應氨基酸引入合成位點的作用。（4） T環(huán)：含胸腺嘧啶核苷和假尿嘧啶核苷為特征。（5）額外環(huán)：是tRNA分類的標志 三級結構 倒“L”形,ACC,DHU環(huán),T環(huán),反密碼環(huán),5,額外環(huán),mRNA的結構,3-poly A(30200)，為mRNA的“尾” 5-7甲基鳥苷三磷酸，為mRNA的“帽” 分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。中間為密碼子 Codon。這些三聯(lián)體密碼子決定蛋白質(zhì)的一級結構,核酸的理化性質(zhì)：含量和分子大小,細胞中核酸含量依種屬及組織而定，如酵母含0.1%，肌肉組織及細菌含0.5% 1%，在胸腺及精細胞中，含量高達1540%。 分子大小可用長度、鹼基對數(shù)目及分子量

14、表示。長1m的DNA含3000鹼基對，相當于分子量為2106 daltons。 DNA分子大小測定的經(jīng)典方法：超速離心測沉降系數(shù)（S）,核酸的理化性質(zhì)：酸性化合物,兩性但酸性強：DNA、RNA在其多核苷酸鏈內(nèi)既有酸性的磷酸基又有堿性的含氮雜環(huán)堿，因此核酸與蛋白質(zhì)一樣，也是兩性電解質(zhì)。因磷酸基的酸性較強故通常核酸表現(xiàn)為酸性。 電泳行為泳向正極（pH7-8）：在中性或堿性溶液中，核酸帶負電荷，在外加電場作用下向陽極移動。 沉淀行為加鹽（中和電荷） M+與磷酸“-”中和；乙醇：帶負電荷的核酸可與金屬離子成鹽。當向核酸溶液中加入適當鹽溶液后，帶正電荷的金屬離子即可將核酸的負離子中和，在有乙醇或異丙醇存

15、在時核酸即可從溶液中沉淀析出。制備核酸時常用的鹽溶液有氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。,核酸的理化性質(zhì)：降解,酸水解：DNA較RNA更敏感，N糖苷鍵斷裂，嘌呤鹼比嘧啶鹼更不穩(wěn)定 鹼水解：DNA對鹼穩(wěn)定，鹼水解多用于RNA。鹼使RNA分子中磷酸二酯鍵的磷酸與C-5酯鍵水解斷裂，生成2核苷酸與3核苷酸的混合物。 酶降解：內(nèi)切酶（胰DNase I)、外切酶（蛇毒磷酸二酯酶）,核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì),粘度 DNARNA 核酸的分子量很大，核酸溶液具有較大的粘性。DNA分子的長度與其直徑之比可達107，因此即使極稀的DNA溶液也有較大的粘度。RNA溶液的粘度較DNA為小。當核酸溶液受熱或酸堿等因素作

16、用下發(fā)生變性時，分子長度與直徑比例減小，分子不對稱性變小，溶液粘度下降。 粘度測定可用作DNA變性的指標。,核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì),超離心沉降 不同種類核酸分子的大小不同。核酸分子大小表示方法有以下幾種：即千道爾頓(kD)、堿基對(bp)或千堿基對(kb)數(shù)目、離心沉降常數(shù)(s)。離心沉降常數(shù)是利用高分子的核酸分子大小不同，分子形狀不同，在超離心力場作用下的沉降行為也各不相同而測得。如真核生物核糖體小亞基中含的rRNA分子大小為18S，大亞基中的rRNA有28S、5S和5.8S三種分子。,核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì),凝膠過濾 高分子的核酸還表現(xiàn)為特異的凝膠過濾(如葡聚糖凝膠)洗脫行為，洗脫

17、時分子量大的先被洗出，分子量小的后洗出。,核酸的紫外吸收,核酸中的嘌呤鹼、嘧啶鹼及其組成的核苷、核苷酸及核酸對紫外光都有強吸收作用。其共同特點是對在260nm處的紫外光有最大的吸收值。 低色效應（Hypochromic effect）：DNA雙螺旋松散后，所得的光吸收值幾乎是其組成中所有核苷酸光吸收值的總和。雙螺旋重新形成時，鹼基間氫鍵的連系及鹼基對間的萬德華氏力作用，可使260nm處的紫外光吸收值下降。 核酸分子中鹼基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等，可根據(jù)核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來測定核酸量。 換算：1 OD260nm 雙鏈DNA = 50 g/ml 1 OD260nm 單鏈DNA

18、= 37 g/ml 1 OD260nm 單鏈RNA = 40 g/ml,變性、復性與雜交,核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結構破壞稱核酸變性。 根據(jù)變性因素區(qū)分為堿變性、熱變性等。 如DNA的堿變性、DNA的熱變性，其中以DNA的熱變性更具典型意義,DNA的熱變性,粘度改變，鋼性線性分子變得無序，粘度下降,UV吸收增強，其規(guī)律如下：,高色效應 hyperchromic effect,核酸變性后、氫鍵破壞，雙螺旋結構破壞，堿基暴露，紫外吸收（260nm）增強，謂高色效應,解鏈溫度融解溫度 melting temperature，Tm,UV吸收增值達到最大吸收增值50%時的溫度，稱Tm,Tm值與 D

19、NA G+C含量有關，G+C含量愈大，Tm愈高，反之則低。 與核酸分子長度有關，分子愈長，Tm愈高。,變性溫度范圍與DNA樣品均一性有關，分子種類愈純（單一），長度愈一致，其變性范圍愈窄，反之則變性溫度范圍愈寬。,DNA變性的復性 renaturation,DNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補鏈之間對應的堿基對再形成氫鍵，恢復完整的雙螺旋結構，稱DNA熱變性的復性。 核酸復性時UV下降，此稱低色效應 （hypochromic effect）,DNA熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火 annealing,DNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補鏈堿基之間來不及配對互補，形成氫鍵

20、聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。,核酸分子雜交 hybridization,當不同來源的核酸變性后一起復性時，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對，出現(xiàn)復性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。,核酸分子雜交,膜上固相雜交,雜交探針技術,采用一小段已知序列的單鏈(含數(shù)十個核苷酸)核酸，經(jīng)同位素或其它小分子或發(fā)光物質(zhì)標記其末端或全鏈，即為核酸探針(probe)。 在適當條件或環(huán)境中與待測核酸樣品雜交，通過放射性同位素自顯影、顯色、發(fā)光或熒光檢測，判斷待測的核酸分子是否含有與探針同源的核酸序列。 探針技術已廣泛用于分子生物學、分子遺傳學基因分析及臨床醫(yī)學診斷，后者已發(fā)展為

21、一門獨立的新型學科DNA診斷學，又稱基因診斷。,DNA的生物合成,DNA生物合成的概念 生物體內(nèi)由DNAP催化合成DNA的過程，包括 DDDP指導的DNA合成復制 RDDP指導的DNA合成反轉(zhuǎn)錄 DDDP、重組酶或SOS系統(tǒng)酶參與的DNA修復,DNA的復制合成,半保留復制概念 復制起始點（ori）和方向（5 3） 復制體系E.coli為例 DnaB（識別ori）、解旋酶(Topo)、解鏈蛋白(Rep蛋白)、引發(fā)酶/前體、DNAPIII、DNAPI、DNA連接酶,半保留復制,DNA合成進行時，以兩條親代DNA鏈中的每條鏈為模板，在DNA指導下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對原則合成子代DNA的過程稱DNA的復制(replicati