SDS-PAGE配方

1、.SDS-PAGE1) 根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分離膠(即下層膠)：SDS-PAGE分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kD成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠51015203050蒸餾水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510

2、%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）8%膠51015203050蒸餾水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同體積SDS-PAGE分離

3、膠所需各成分的體積（毫升）10%膠51015203050蒸餾水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠51015203050蒸餾水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08

4、.012.020.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠51015203050蒸餾水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨

5、0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非變性膠，參考上述配方，不加10%SDS即可配制成非變性PAGE膠。10%過硫酸銨配好后可以在4D冰箱放兩周，但是最好新鮮配置效果好。1) 按照如下表格配制SDS-PAGE的濃縮膠(也稱堆積膠、積層膠或上層膠)：成分配制不同體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%膠2346810蒸餾水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH8.80.250.380.50.751.01.251

6、0%SDS0.020.030.040.060.080.110%過硫酸銨0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.015XTris-Glycine 電泳緩沖溶液 1L0.125M Tris， 1.25M Glycine， 0.5% W/V SDSTris 15.1 gGlycine 95 gSDS 5.0 g5X SDS-PAGE 加樣緩沖液：5ml250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 m

7、LSDS： 0.5 gBPB: 25mgGlycerol: 2.5ml2-ME: 使用時(shí)加入小份（25微升），新鮮使用。TBST 緩沖液每2L體積中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐溫1ml1) 抗體去除液每50mL抗體去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAGE電泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其

8、序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；T