木瓜蛋白酶的提取純化實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、;木瓜蛋白酶的分離純化一、目的 （1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果實(shí)中的乳汁中提取粗酶液，并進(jìn)一步純化，獲得高純度的木瓜蛋白酶。（2）通過此次試驗(yàn)，熟悉掌握木瓜蛋白酶分離純化的基本步驟和原理，了解離心分離，萃取等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、原理 木瓜蛋白酶（ Papain ）是一種巰基蛋白酶，它分解比胰臟蛋白水解酶更多、更廣泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量約為 23000 左右。在 25 , pH6.2 時(shí)， 1 分鐘生成1umol酪氨酸的酶量為 1 單位。木瓜蛋白酶是單條肽鏈，有 211 氨基酸殘基折疊成兩部分形成裂縫，酶分子只有 1 個(gè)巰基，對酶活力是必需的，激活劑有半

2、胱氨酸，硫化物，亞硫酸鹽和 EDTA ；抑制劑有巰基試劑，包括重金屬和羧基試劑和過氧化氫。 酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū) 275nm 處有吸收峰，根據(jù)測定 275nm 處的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小與酪氨酸含量的多少有關(guān)，吸收值大說明酪氨酸含量高，也就是說木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。 三、實(shí)驗(yàn)材料 番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量為6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考馬斯亮藍(lán)四、儀器設(shè)備 （ 1 ） 離心機(jī) 4000-1000rpm （冷凍式或非冷凍式） （ 2 ） 752 紫外分光光度計(jì) （ 3 ）

3、 水浴箱 （ 4 ） 冰箱 （ 5 ） 榨汁機(jī) 五、玻璃器皿（以組為單位） 試管 （ 6 ）， 100 mL 燒杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），試劑瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），濾紙（ 3-6 ）等 六、實(shí)驗(yàn)試劑配制及實(shí)驗(yàn)步驟 （一）酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線試管編號012345標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液 ( ml )00.20.40.60.81.0蒸餾水（ ml ）21.81.61.41.21紫外吸光度A275nm00.0660.1750.3000.4300.550將上述各管

4、混勻，靜置 2min, 測定各管的 A 275nm，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如下：（二）粗酶活測定 1 試劑 （ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸緩沖液， pH 7.2 配制） （ 2 ）0.1mol/L 的磷酸緩沖液， pH 7.2 （ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸 （ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）配制 （ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液 2 方法 量取酶液0.2 mL，加入激活劑0.25 mL于帶塞試管中，在37水浴中保溫8 min，吸取預(yù)熱37

5、酪蛋白液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）1 mL加入此管，在37水浴中反應(yīng)10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL搖勻，靜置5 min；另取樣液（已激活）0.3 mL置另一帶塞試管中，加入TCA 2 mL，37保溫10 min后，加入預(yù)熱至37的酪蛋白液1 mL，靜置5 min，測2個(gè)管的A275 nm值，同時(shí)做2個(gè)平行試驗(yàn)。管號0 （對照）1 （樣品）2( 樣品 )酶液（ ml ）0.20.20.2激活劑（ ml ）1.81.81.837 度預(yù)熱 10 分鐘1% 酪蛋白（ ml ）01.01.037 度水浴 10 分鐘TCA （ ml ）2.02.02.01% 酪蛋白（ ml ）1.000搖勻，靜置

6、5 分鐘過濾OD 275nm0.0000.1030.108 （三）純化固定體系總質(zhì)量為20.5 g，在PEG（分子量6 000）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.0%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.6%，pH值為5.0，粗酶添加量為7.5%所組成的雙水相體系下，室溫下靜置分相后，讀取上、下相體積，計(jì)算相體積比R，分別測定上、下相的酶活力體積ml紫外吸光度A275nm上相90.32下相170.02（四）計(jì)算與結(jié)果R = 9/17 = 0.529粗酶活 = （0.103 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.03 = 156.16上相酶活 = （0.32 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.02 = 804.7下相