電泳基本理論

1、電泳基本理論 內(nèi)容摘要 1 概述 2 電泳的基本原理 3 電泳系統(tǒng) 4 支持介質(zhì) 5 染料 6 影響因素,1電泳概述 1.1電泳的定義 帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。 電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的一類實驗技術(shù)。 帶電顆粒在電場中移動是物質(zhì)的一種運動現(xiàn)象。移動的速度與顆粒帶電的強弱、分離介質(zhì)的阻力、電極液的粘度和電場強度等因素有關(guān)。生物大分子在電場中移動的速度除上述因素外還與分子形狀、相對分子質(zhì)量大小、分子的帶電性質(zhì)及數(shù)目等因素有關(guān),1.2電泳技術(shù)的發(fā)展過程 電泳現(xiàn)象

2、早在1808年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但電泳作為一種分離技術(shù)卻是在1937年由瑞典科學家Tiselius A首先提出來的，并設計出世界上第一臺自由電泳儀，建立了“移界電泳”分離模式。他用光學方法觀察到在電泳遷移過程中血清蛋白質(zhì)界面的移動，首先證明了血清是由白蛋白、1、2、和球蛋白組成的，為表彰他對電泳技術(shù)所做出的突出貢獻，1948年他被授予諾貝爾獎,20世紀50年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。 60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。 1967年Shapiro A L等在凝膠電泳的基礎上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電

3、泳技術(shù)。 70年代以后根據(jù)不同需要推出了多種電泳模式，如圓盤電泳、垂直板電泳、雙向電泳、脈沖電泳、等電聚焦電泳、印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù),90年代又推出了分辨率極高的高效毛細管電泳。多年來科學家們對電泳結(jié)果的分析做了大量的工作，建立了各種實驗方法，電泳后對分離物質(zhì)可以用染色、掃描、紫外吸收、放射自顯影、生物活性測定等方法進行分析，得到所需數(shù)據(jù),1.3電泳的常用術(shù)語 (1)電泳遷移(electrophoretic migration)： 在電泳過程中，帶電粒子在電場的作用下做定向移動，單位是cm。 (2)遷移時間(migration time)：用tm表示 在電泳過程中，帶電粒子在電場的作用下做定向移

4、動所用的時間，單位是min。 (3)電泳速度(electrophoretic velocity)：用Vep表示 在單位時間內(nèi)，帶電粒子在電場的作用下做定向運動的距離，單位是cm /sec,4)電場強度(electric field strength)：用E表示 在給定的電泳支持物兩端電極施加電壓后所形成的電效應，單位是 V/cm。 E = V /Lt 式中V為電壓，Lt為兩端電極的距離,5)電滲流(electroosmotic flow)：用EOF表示 在電場中電泳溶液的正電荷與固體支持物表面上的負電荷之間相互作用，形成一個正離子層，導致流體朝負極方向移動，稱為電滲流，這種現(xiàn)象也稱之為電滲(e

5、lectroosmosis)現(xiàn)象,如圖,電滲流遷移速度(Vep)的表達式為： 電滲流遷移速度Vep = E 4 式中為電解常數(shù)，為支持物與表面平切面的Zeta電勢，為緩沖液粘度，E為電場強度。 通常情況下，電滲流總是由正極向負極移動，只有在特殊情況下如分離堿性蛋白質(zhì)的陰極電泳時溶液pH較低，固體支持物表面帶正電荷，形成向正極移動的電滲流。電滲流的大小受到Zeta電勢，偶電層厚度和緩沖液粘度等因素的影響，直觀地看電滲流隨著電解質(zhì)濃度的增加而增加，隨著pH值的增加而加大,6)相對遷移率(relative mobility)：用mR表示蛋白質(zhì)樣品的遷移距離與示蹤染料的遷移距離之比即為相對遷移率，即

6、蛋白質(zhì)的遷移距離(cm) mR = 示蹤染料的遷移距離(cm,2電泳的基本原理 2.1帶電顆粒 溶液中任何物質(zhì)由于其本身的解離或表面吸附其它帶電質(zhì)點而帶電，在電場中就會發(fā)生遷移，移動方向取決于它們的帶電符號。 NaCl Na+ + Cl 生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于溶液終的H+濃度,2.2電泳遷移率(mobility) 如果把生物大分子的膠體溶液放在沒有干擾的電場中，使帶電顆粒具有恒定遷移率的驅(qū)動力來自于顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E，即： F = QE (1) 帶電顆粒在遷移中同時受到來自于介質(zhì)的摩擦力F，對于球形顆粒來說，在自由溶液中此阻力服從S

7、tock定律： F = 6 r v (2) 這里v是在介質(zhì)粘度為的溶液中，半徑為r的帶電顆粒的移動速度。但在凝膠中，這種阻力并不完全符合Stocks定律。F還取決于介質(zhì)中的其它因素如凝膠厚度、顆粒大小和介質(zhì)的內(nèi)滲等,當帶電顆粒達到穩(wěn)態(tài)運動時，F(xiàn)=F，由(1)、(2)式推導出： v Q = （3） E 6r 不同的帶電顆粒在同一電場中運動速度不同，其泳動速度用遷移率（或稱泳動度）m來表示，定義為在電位梯度E(V/cm)的影響下，顆粒在時間t(s)中遷移距離d(cm)，即在單位電場強度(1 V/cm)時的泳動速度： v d m = = (4) E tE,將(3)代入(4)，得到 Q m = (5)

8、 6r 由上式可看出電泳遷移率與球形分子、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的物化特性常數(shù)。從(4)式可以導出遷移率的單位是cm2s-1V-1,2.3帶電顆粒的移動速度v與電位梯度E、電流密度J和導電性K的關(guān)系 如果在同樣實驗條件下對某蛋白溶液做兩個電泳試驗，一個試驗用兩倍的時間一倍的電壓，另一個試驗用一倍的時間兩倍的電壓，從理論上講，這兩個試驗中蛋白質(zhì)的遷移距離應該是相等的。但是實際上只能是大致相等，原因是在電泳過程中還有其他因素的干擾，如在增加電壓的同時也增加了熱效應。移動的速度決定于其分子的形狀、相對分子質(zhì)量的大小、分子帶電性質(zhì)及數(shù)目，還與分離介質(zhì)

9、的阻力、溶液粘度及電場強度等因素有關(guān),我們把帶電顆粒的移動速度用以下公式表示 v = mE= mJ/K (6) 由此可以看出，帶電顆粒的移動速度v等于電位梯度E和遷移率m的乘積，與電流密度J和遷移率m的乘積成正比，與溶液的導電性K成反比。也就是說，電場強度越高電泳速度越快；溶液的導電性越強，電泳速度越慢。因此電泳速度隨著電位梯度或溶液的導電性的變化而改變,3電泳的分類 3.1按分離原理分類 (1)區(qū)帶電泳(zone electrophoresis，ZEP)：是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后在介質(zhì)上加電場，帶電顆粒在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)內(nèi)遷移，在電泳過程中，不同的離子成分在均

10、一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨立的區(qū)帶(圖3-2a)，這是當前應用最廣泛的電泳技術(shù),2)移界電泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：是把電場加在生物大分子溶液和緩沖溶液之間的界面上，帶電顆粒的移動速度通過光學方法觀察界面的移動來測定(圖3-2b)。 (3)穩(wěn)態(tài)電泳(steady state electrophoresis)：帶電顆粒在電場作用下電遷移一定時間后達到一個穩(wěn)定狀態(tài)，此后，電泳條帶的寬度不隨時間的變化而變化，如等速電泳(isotachophoresis，ITP)、等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)(圖2c、2d,a b

11、 c d,圖3-2 各種電泳分離原理示意圖 a 區(qū)帶電泳 b 移界電泳 c 等速電泳 d 等電聚焦,4電泳系統(tǒng) 4.1電泳儀及附屬設備 從第一臺商品自由移界電泳系統(tǒng)的問世以后，近50年來電泳儀器的發(fā)展迅猛，尤其是隨著凝膠電泳技術(shù)的成熟及廣泛應用，各種類型的凝膠電泳裝置層出不窮，使電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。凝膠電泳儀作為實驗室的常規(guī)小型儀器，種類很多。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，電泳儀器的分析對象也越來越專門化，分辨率越來越高，操作越來越簡單，性能越來越穩(wěn)定。凝膠電泳系統(tǒng)主要包括電泳儀、電泳槽及附屬設備三大類,4.2電泳儀： 根據(jù)電泳儀的電壓設計范圍可將其分為三類： (1)常壓電泳儀(600V)：用于凈

12、電荷和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳； (2)高壓電泳儀(3000V)：用于載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳和DNA測序； (3)超高壓電泳儀(30000-50000V)：用于毛細管電泳,4.2電泳槽： 根據(jù)電泳種類不同，對電泳槽的設計也不一樣。電泳槽主要有自由界面電泳槽、管狀電泳槽、板式電泳槽。 (1)自由界面電泳槽 Tiselius設計的自由界面電泳槽（圖3-3）是一個U形玻璃管，在U形管下部放待分離的蛋白溶液，管臂聯(lián)接到電極上，在電場的作用下，緩沖系統(tǒng)中蛋白質(zhì)界面的移動可用光學系統(tǒng)“紋影法(schlieren)”照相，得到電泳圖譜。這種電泳槽目前已不使用。90年代初發(fā)展起來的高效毛細管電泳就是根據(jù)

13、自由界面電泳槽的原理而設計的,3 Tiselius自由界面電泳裝置示意圖,2)管狀電泳槽 50年代末商品圓盤電泳槽問世。圓盤電泳槽有上下兩個電泳槽和帶有鉑金電極的蓋，上電泳槽具有若干個孔，可插電泳管。將丙烯酰胺凝膠貯液裝在玻璃管內(nèi)，凝膠在電泳管中聚合成柱狀膠條，樣品經(jīng)電泳分離，蛋白區(qū)帶染色后呈圓盤狀，因而稱圓盤電泳(disc electrophoresis,圓盤電泳槽,3)板狀電泳槽 板狀電泳槽是目前使用最多的電泳槽，是將凝膠灌裝在兩塊平行的玻璃板中間，因而稱板狀電泳(slab electrophoresis)。板狀電泳的最大優(yōu)點是包括標準相對分子質(zhì)量蛋白在內(nèi)的多個樣品可在同一塊凝膠上在相同的

14、條件下進行電泳，便于利用各種鑒定方法，直接比較各樣品的區(qū)帶，保證結(jié)果的準確可靠；還可進行雙向電泳。另外，板膠電泳時產(chǎn)生的熱量容易消散，凝膠電泳結(jié)果便于照相和制成干膠。板狀電泳槽有垂直板電泳槽和水平板電泳槽,垂板電泳槽 轉(zhuǎn)移電泳槽,平板電泳槽 雙向電泳槽,制備電泳槽,4.3附屬設備 隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，電泳技術(shù)的種類逐漸增加，凝膠電泳在制膠、電泳系統(tǒng)的冷卻、凝膠染色及結(jié)果分析等方面手段日趨完善，科學家們研制出各種電泳附屬設備，如梯度混合儀、外循環(huán)恒溫系統(tǒng)、脫色儀、凝膠干燥系統(tǒng)、凝膠掃描儀、凝膠成像儀等,5電泳的操作模式 目前最常用的電泳操作模式是區(qū)帶電泳中的聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳，前

15、者主要用于蛋白質(zhì)的分離鑒定，后者主要于核酸的分析鑒定。電泳的操作模式有按操作方式和分離原理分類,5.1按電泳方式分類 (1)端電極電泳：有垂直式和水平式兩種方式，多用于蛋白質(zhì)電泳。 (2)搭橋電泳：為水平式，水平板狀電泳槽形式多樣，凝膠和緩沖液通過間接接觸的方式，如用濾紙橋搭接，用緩沖液制作的凝膠條或濾紙條搭接（圖3-4），后兩者即半干技術(shù)，多用于免疫電泳、等電聚焦,A B C,圖4 水平板狀電泳中凝膠與緩沖液的接觸方式 A 濾紙橋 B 凝膠條 C 濾紙條 (3)潛水電泳： 為水平式，電泳時凝膠浸于緩沖液中，多用于核酸電泳,5.2按分離原理分類 (1)凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳； (2)SDS-

16、聚丙烯酰胺凝膠電泳； (3)聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳； (4)聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳； (5)聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦； (6)聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移印跡電泳； (7)瓊脂糖凝膠水平電泳； (8)瓊脂糖凝膠脈沖電泳； (9)瓊脂糖凝膠免疫電泳,6凝膠電泳的支持介質(zhì) 6.1支持介質(zhì)的性質(zhì) 采用支持介質(zhì)進行電泳的目的是防止在電泳過程中分子的對流和擴散，使被分離物質(zhì)得到更有效的分離。支持介質(zhì)應當具備以下特性： (1)物理化學性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。 (2)化學惰性：在電泳過程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學反應，不干擾生物大分子的電泳過程。 (3

17、)分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復性好,6.2支持介質(zhì)的分類 電泳的固體支持介質(zhì)可以分為兩類: (1)薄膜類： 薄膜類包括紙類，醋酸纖維素薄膜，聚酰胺薄膜等. 這類支持介質(zhì)化學惰性好，在電泳過程中產(chǎn)生的對流和擴散較小，分離的基本原理主要是基于生物大分子的電荷密度,2)凝膠類：凝膠類包括淀粉凝膠，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠等。 這類介質(zhì)相對薄膜類又了進一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在電泳過程中不僅能防止對流，減小擴散，還具有凝膠的多孔性，孔徑與蛋白質(zhì)分子大小大致相同，因而能產(chǎn)生分子篩效應(molecular sieving effect)，其分離作用既與電荷密度有關(guān)，又與分子大小有關(guān)，因而凝膠的

18、分離原理是基于大分子的電荷密度和分子大小，對分離不同相對分子質(zhì)量的生物大分子極為有利。所以，生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸電泳多采用凝膠類介質(zhì)。淀粉凝膠由于質(zhì)量難以控制，操作繁瑣，分辨率低，實驗室中已很少使用，現(xiàn)在用得最多的是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠,7凝膠支持介質(zhì) 7.1聚丙烯酰胺凝膠 7.1.1聚丙烯酰胺凝膠的特性 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacrylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成

19、的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophorsis，簡稱PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠用于電泳的支持介質(zhì)，與其它凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠具有以下優(yōu)點,1)孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，具有良好的分子篩效應。根據(jù)待分離大分子的相對分子質(zhì)量，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)劑度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，使大分子得到較好的分離。 (2)在一定濃度范圍內(nèi)，凝膠透明，有彈性，機械性能好 (3)凝膠是由CCCC結(jié)合的酰胺類多聚物，側(cè)鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有其它帶電基團，所以凝膠性能穩(wěn)定，電滲作用小，無吸附，化學惰性強。與生物大分子不

20、發(fā)生化學反應，電泳過程中不受溫度、pH的變化的影響,4)具有高分辨率和靈敏度，尤其是在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，樣品不易擴散。并有多種染色方法提高電泳條帶顯色的靈敏度，分離蛋白質(zhì)的靈敏度可達10-6g。 (5)單體純度高，在相同的實驗條件下，電泳結(jié)果具有很好的重復性,6)凝膠雜質(zhì)少，在很多溶劑中不溶，可適用于少量樣品的制備，不致污染樣品。 以聚丙烯酰胺凝膠為支持物發(fā)展起來的電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳、等電聚焦及雙向電泳等電泳技術(shù)，不僅能分離、小量制備生物大分子，而且可以用來研究生物大分子的性質(zhì)如電荷、相對分子質(zhì)量、等電點以

21、及構(gòu)象等,7.1.2聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式 聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學催化（APTEMED）和光化學催化（核黃素TMTED）體系。 (1)AP-TMTED催化體系：屬于化學聚合作用，TMTED是一種脂肪族叔胺，分子式為,H3C /CH3 N(CH2)2N H3C/ CH3,它的堿基可催化溶液中的AP使其形成游離氧自由基，激活Acr單體形成單體長鏈，同時在交聯(lián)劑Bis的作用下長鏈彼此交聯(lián)聚合成凝膠，反應式如下： TEMED催化AP生成硫酸自由基：

22、 S2O82 2SO4 硫酸自由基的氧原子激活Acr單體并形成單體長鏈,Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),聚合反應受各種因素的影響，如系統(tǒng)中催化劑和加速劑的濃度、pH、溫度、分子氧和雜質(zhì)都會影響凝膠的聚合過程。 (2)核黃素-TEMED催化系統(tǒng)：屬于光聚合作用，聚合原理是核黃素在光照條件下分解，被還原成無色核黃素，后者在有少量氧的條件下，被氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應,7.1.3 凝膠總濃度及交聯(lián)度與凝膠的性質(zhì)： (1) 凝膠總濃度與凝膠特性： 凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性，包括其機械性能、彈性、透明度、粘著度及孔徑大小的主要參數(shù)。1962年Hjertn

23、 S引入兩個計算公式，即凝膠總濃度（T）是表示凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總百分含量 a+b T = 100% m 交聯(lián)度（C）是表示凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分含量,b C = 100% a+b 式中，a為丙烯酰胺單體的質(zhì)量(g)，b為交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量(g)，m為溶液的終體積(ml)。 凝膠a、b的比例是很重要的，決定了凝膠的物理性狀。 當a:b小于10時，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色； 當a:b大于100時，即使用5%的丙烯酰胺凝膠也呈糊狀； 通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺濃度高于3%，凝膠富有彈性并且透明,1) 凝膠總濃度及交聯(lián)度對孔徑的關(guān)系： 聚丙烯酰胺

24、凝膠的有效孔徑取決于凝膠的總濃度T和交聯(lián)度C。 有效孔徑隨著T的增加而減小，電泳中帶電顆粒移動時受到網(wǎng)孔的阻力大，反之帶電顆粒受到的阻力小。 當凝膠總濃度小于2.5%時，可以篩分相對分子質(zhì)量為106以上的大分子，但此時凝膠幾乎是液體，通常要加0.5%的瓊脂糖來增加凝膠的硬度而不影響凝膠的孔徑大??； 當凝膠濃度大于30%時，則可以篩分相對分子質(zhì)量小于2kD的多肽, 在凝膠總濃度一定時，交聯(lián)劑含量不同影響凝膠的孔徑，交聯(lián)劑的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系見表3-1,表3-1 Bis的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系,從表中可以看出，當Bis占總凝膠濃度5%時，凝膠的平均孔徑在各凝膠濃度時

25、均最小，高于或低于5%時孔徑相應變大。 凝膠孔徑大小也受凝膠總濃度的影響，一般凝膠總濃度越高，凝膠孔徑越小。凝膠孔徑大小有一定范圍，每次制備凝膠時所得到的有效孔徑不完全相同,3)凝膠總濃度與凝膠的分子篩效應： 凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應，在凝膠中生物大分子的分離取決于它的凈電荷和分子大小。分子篩效應的大小取決于凝膠孔徑大小與生物大分子大小相接近的程度。凝膠濃度不同，平均孔徑也不同，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時所受的阻滯力也不同，加上大分子的電荷效應，使各種大分子遷移率不同得以分離,在實際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已知相對分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度

26、的分離，表3-2列出了蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系。大多數(shù)蛋白質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個濃度的凝膠稱為標準膠。當分析一個未知樣品時，常用標準膠或梯度凝膠來測試，而后確定適宜的凝膠濃度,表3-2 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系,7.2 瓊脂糖凝膠 7.2.1瓊脂糖凝膠的特性 瓊脂糖(agarose)是從瓊脂中精制出來的膠狀多糖(gel-forming polysaccharide)，瓊脂又是從天然的紅色的墨角藻(red-seaweed)中提取出來的。瓊脂含有兩種多糖，即瓊脂糖和瓊脂膠，從瓊脂膠中脫去硫酸酯基和丙酮酸酯基就可獲得瓊脂糖。瓊脂糖的分子結(jié)構(gòu)大部分是由1,3連

27、接的-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-D吡喃半乳糖交替而成,1) 瓊脂糖凝膠屬于大孔膠，可以分析107的大分子，但電泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝膠電泳。這種大孔特性有利于免疫固定、免疫電泳和微量制備。瓊脂糖形成凝膠后孔徑的大小取決于瓊脂糖百分濃度，如表3-3； 表3-3瓊脂糖凝膠的濃度與孔徑的關(guān)系,2)具有穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)，對樣品吸附極小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好； (3)具有較高的機械強度，允許在1%或更低的濃度下使用，且在這種濃度下仍然有篩分和抗對流作用； (4)瓊脂糖無毒，具有熱可逆性，膠凝過程不需催化劑，制備簡單、快速。低膠凝溫度及低熔點的瓊脂糖有利于樣品回收，達到樣品制備

28、的目的； (5)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，染色、脫色程序簡單快速,7.2.2瓊脂糖凝膠的主要性能指標： (1)電內(nèi)滲(electroendosmosis，簡稱EEO)：是瓊脂糖電泳中由多糖骨架上的帶電基團引起，主要是硫酸酯和丙酮酸鹽，這些陰離子基團被固定在介質(zhì)中，相應的陽離子與其結(jié)合水一起向陰極移動（圖3-6），電內(nèi)滲對DNA的分離沒有顯著影響，但高電內(nèi)滲時對大分子的遷移有一定阻礙作用，電泳耗時較長,1) 膠凝溫度：將瓊脂糖在溶液中加熱至90溶解，然后將溫度下降至某一溫度時由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，此溫度即為凝固點，稱為膠凝溫度。一般在3543。 (3)熔化溫度：將凝固的凝膠由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)

29、時的溫度即熔化點，稱為熔化溫度。一般在7590。用于制備目的時，采用低熔點瓊脂糖，熔化溫度需低于30,4)凝膠強度：定義為每平方厘米凝膠所能承受的重量(g /cm2)，凝膠強度與凝膠濃度成正比。凝膠強度越高，所能允許使用的凝膠濃度越小。在電泳中通常使用1%的瓊脂糖凝膠。尿素和碘化鉀等阻礙氫鍵形成的試劑也會降低凝膠強度，使凝膠變軟易碎，給操作帶來困難。 (5)脫水收縮作用：是指瓊脂糖凝膠中擠壓出液體的現(xiàn)象，使用時要用濾紙吸干凝膠表面的水,7.2.3 瓊脂糖凝膠電泳在核酸研究中的應用： 由于瓊脂糖凝膠孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，其分子篩效應微不足道。以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)的電泳已廣泛應用于核酸

30、研究中，為DNA分子及其片段的相對分子質(zhì)量測定和DNA分子構(gòu)象的分析提供了重要手段。瓊脂糖對DNA的分離范圍較廣，用不同濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至50kb的DNA。從表3-4中可以看到凝膠的濃度越低，適用于分離越大的DNA,表3-4 不同瓊脂糖凝膠濃度與分離DNA大小范圍的關(guān)系,7.3新型凝膠介質(zhì) 雖然聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠是目前最常用的兩種支持介質(zhì)，但是它們還存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝膠聚焦的重復性較差，瓊脂糖凝膠容易斷裂等。近年來人們正在尋求新型的電泳材料。 第一類：丙烯酰胺單體替代物如poly-N-acryloyl-tris(NAT)、N-acryloyl suga

31、rs、N-acryloylaminoethoxye thanol(AAEE)等。這類N-取代聚丙烯酰胺材料具有以下優(yōu)點,具有較強的水解穩(wěn)定性，在較廣的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，能在pH213環(huán)境中進行電泳，適合作為酸堿性pH范圍等電聚焦的支持介質(zhì)； 具有高度的親水性和大孔性，適合大相對分子質(zhì)量物質(zhì)的分離；凝膠的機械強度高,第二類：聚丙烯酰胺瓊脂糖混合物(Polyacrylamide-agarose mixture)、聚丙烯酰胺瓊脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidyl mixture)，這類電泳支持介質(zhì)具有以下優(yōu)點： 具有聚丙烯酰胺分辨率高和瓊脂糖大孔徑的優(yōu)點，機械強

32、度高，又具有良好的彈性，適合分離特大分子(2500kD)，可用于病毒、SDS變性分子和高相對分子質(zhì)量的脂蛋白,第三類：“電泳海綿”，是一些海綿狀的支持介質(zhì)材料，還處于試驗階段，但它與聚丙烯酰胺和瓊脂糖相比具有很多優(yōu)點： 機械強度大，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以是親水的也可是疏水的； 可以直接測量孔徑，孔徑范圍在nm100m,8 蛋白染染料 用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復合物是電泳后檢測最常用的方法。選擇高吸光系數(shù)的染料，與生物大分子緊密結(jié)合，形成有色不溶的復合物，而支持介質(zhì)不吸附染料，便于背景的脫色，有利于蛋白質(zhì)條帶的辨別和定量掃描，從而檢測出蛋白質(zhì)的純度、含量及生物活性。 可用于蛋白質(zhì)電泳條帶的染色方

33、法很多，常用的主要有以下幾種,8.1氨基黑類染色： 蛋白質(zhì)染色最早是用氨基黑類染料，是一類含有磺酸基的酸性染料，它通過磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團形成復合鹽。常用的有： 氨基黑10B(amino black 10B) 萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200) 萘酚籃黑6B(naphthol 6B) 水牛黑(buffalo black)等,這類染料對不同的蛋白質(zhì)著色不同，有 藍色 棕色 黑色， 借此可以鑒別不同類型的蛋白質(zhì)。這類染料對不同的蛋白質(zhì)結(jié)合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質(zhì)的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍所代替,8.

34、2考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue，簡稱CBB) 在蛋白質(zhì)染色中，目前考馬斯亮藍染色法最為常用，1965年考馬斯亮藍應用于聚丙烯酰胺凝膠染色，它步驟簡便、靈敏度較高，可進行定量掃描。它可分為R和G型兩類： R型為三苯基甲烷(triphenylmethane)，每個分子含有兩個SO3H基團，本身偏酸性，磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團結(jié)合形成染料蛋白質(zhì)復合物。 G型為二甲花青亮藍(xylene cyanine brilliant blue)，是一種甲基取代的三苯基甲烷?？捡R,考馬斯亮藍R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色。它與不同蛋白質(zhì)結(jié)

35、合呈現(xiàn)出基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)（1520 g），掃描峰的面積與蛋白量呈線性關(guān)系。 考馬斯亮藍G-250染色靈敏度不如R-250，其優(yōu)點是在三氯乙酸中以膠體形式存在，能選擇性地和蛋白質(zhì)形成復合物，染色迅速，著色深的蛋白質(zhì)區(qū)帶在數(shù)秒內(nèi)即可顯現(xiàn)出來，約45分鐘后著色最深，本底低，重復性好，適用于定量分析,8.3熒光染料： 是一種在電泳前用熒光分子將蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)標記，于電泳后通過掃描來測定熒光區(qū)帶的方法，但由于熒光標記蛋白質(zhì)的定量需要特殊的掃描裝置，影響了此方法的廣泛應用。研究工作中使用的熒光染料有以下幾種： (1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansyl chloride，簡稱D

36、NS-Cl)：是最早應用的熒光染料，它在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)末端氨基酸發(fā)生反應，使它們獲得熒光性質(zhì)，在280nm和320nm波長的紫外燈下可觀察到電泳條帶,2)熒光胺(fluorescamine，又稱fluram)：作用與丹磺酰氯相似。在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)末端氨基酸發(fā)生反應，產(chǎn)生熒光。其優(yōu)點是由于自身及分解產(chǎn)物均不顯示熒光，標記的蛋白質(zhì)是唯一的熒光物質(zhì)，因此，凝膠沒有熒光背景。 (3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，簡稱MDPF：其作用與丹磺酰氯和熒光胺相似，其優(yōu)點是凝膠上MDPF標記蛋白質(zhì)

37、的熒光可保持數(shù)月。用MDPF標記時，熒光強度在蛋白質(zhì)濃度1500ng范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，標記蛋白做SDS-PAGE分析時，其相對分子質(zhì)量的對數(shù)(log10)與相對遷移率之間呈線性關(guān)系,4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonic acid，簡稱ANS)：染料本身無色，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在紫外光下可顯出黃綠色熒光。電泳后將凝膠置于此染料溶液中，13分鐘后在長波紫外光下即可觀察到熒光蛋白條帶,8.4硝酸銀染色： 目前染色機理尚不清楚，可能是將結(jié)合在蛋白質(zhì)上的銀離子還原成金屬銀而顯色，研究表明蛋白質(zhì)上堿性和含硫氨基酸在銀染中的重要性，染色靈敏度是考馬斯亮藍R-250的

38、100倍左右，可以檢測0.38ng /mm2的牛血清白蛋白。銀染顯色的方法大致可以分化學顯色和光顯色兩類,1)化學顯色法(chemical development)： 又分為雙胺銀染法(diamine silver stains)和非雙胺銀染法(non-diamine silver stains)。 雙胺法：是用堿性的NH4OH形成銀雙胺復合物，固定后的凝膠浸泡在此溶液中，通過酸化（通常用檸檬酸）顯像，使用較廣泛。 非雙胺法：是將固定的凝膠置于酸性的硝酸銀溶液中，銀離子與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，在堿性條件下，用甲醛將銀離子還原為金屬銀而顯像，用酸性溶液（檸檬酸或醋酸）終止顯色反應，用碳酸鈉處理凝膠可進

39、一步增強銀染色的強度。非雙胺法的靈敏度較雙胺法高10倍,2)光顯色(photo development)： 顯色反應是固定后的凝膠在酸性環(huán)境中用光能將銀離子還原成金屬銀而使蛋白條帶顯色，它的優(yōu)點是操作程序簡單，使用一種染色溶液即可達到顯色目的,8.5特殊蛋白質(zhì)染色: (1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通過對蛋白或碳水化合物的染色來檢測。如與糖鏈的反應，用過碘酸-Schiff試劑(periodic-Schiffs reagent)染色，簡稱PAS染色，顯色結(jié)果在543nm處可觀測到顏色。檢測靈敏度，最高可以達到40 ng糖蛋白。 (2)脂蛋白染色：脂蛋白可以用常規(guī)的染色方法，蘇丹黑B(sudan black)是常用的染料，銀染法仍然是最靈敏的方法。近年有報道一種